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在1970年代中期成立,新英格兰Biolabs,Inc。(NEB)是发现和生产分子生物学应用的酶的行业领导者,现在提供了最大的重组和原生研究的选择。NEB继续将其产品产品扩展到与PCR,基因表达,下一代测序,合成生物学,糖生物学,表观遗传学和RNA分析的PCR。此外,NEB专注于加强联盟,使新技术能够达到重点市场部门,包括分子诊断开发。新英格兰Biolabs是一家私营公司,总部位于伊斯文州伊斯文州,并通过位于加拿大,中国,法国,德国,日本,新加坡和英国的独家经销商,代理商和七家子公司进行广泛的全球经销商。有关新英格兰Biolabs访问的更多信息

限制摘要提示:设计限制屏幕

内容赞助新英格兰Biolabs.

限制摘要提示:设计限制屏幕

限制性摘要很简单。但低估了他们的危险。限制性摘要是分子生物学中许多程序的基石,所以让他们正确,并且了解如何判断他们是否出错,是一个重要的技能。限制屏幕,使用限制酶消化载体以产生多个频段的载体,是一种简单且有效的方法,可以确定克隆是否包含所需的插入件。载体和插入件可以包含许多不同的限制性位点,使其令人困惑地选择在设计限制屏幕时产生可解释结果的酶。补充说:并非所有限制酶相等(有些可能是有问题的),并且设计限制屏幕可以是令人生畏的任务。

设置限制屏幕和故障排除屏幕的快速指南将告诉您您需要知道什么。

设计限制屏幕的分步指南

步骤1.制定可用酶的列表

每个实验室技术和他的狗都有一股限制性酶库存,所以为什么不使用可用的东西?写下(按字母顺序)您为您提供的限制酶的列表(如果您正在友好的条款,这可能是您的个人股票,实验室库存,实验室股票或来自其他实验的人)。识别任何潜在的恶作剧限制酶,并尽量避免它们(我在他们旁边放置星号*)。有问题的酶可能是那些:

  • 由甲基化抑制,例如Xbai。
  • 这需要在37以外的温度下孵育O.例如,BSLI需要孵育温度为55O.C虽然SMAI需要孵化温度为25O.C.您可以找到孵化温度的细节NEB的限制酶图表
  • 或只是无论是什么原因不友好的酶。

步骤2.识别插入中的网站

识别插入中的限制站点。Nebcutter v2.0.是一个免费且非常方便的工具,可用于快速识别DNA序列中的限制性位点。如果您可以在插入件中识别两个站点,这将在消化之后生成一个体面的大小频带,这很大,因为这将通过包括仅插入频段增加屏幕的电源。

步骤3.识别您的向量中的网站

看看插入中使用的限制站点是否也存在于向量中,并确定将产生的大小频带。然后选择载体中的许多限制性位点,以消化MCS和围绕MCS的5号和3个侧面上的矢量。选择限制站点,这些站点将在限制屏幕中产生良好的识别频段。

步骤4.执行限制屏幕

试试屏幕!希望它能起作用。如果没有,分析为什么它可能没有工作;回到您的计划并解决克隆中可能存在的网站,以为您提供您获得的结果。建议用不同酶执行第二个屏幕以确认第一屏幕的结果。

希望这个过程能够带你进入更好更好的信息的限制屏幕,以便当那个绊脚石确实掌握,你可以直接跳过它并继续你的快乐后克隆方式。

故障排除限制屏幕

限制性消化可以产生不良结果或由于各种原因而失败。以下是摘要如果您的摘要为您提供令人惊讶的结果或根本没有结果:

  • 限制酶已经失去了活性。这可能是由于年龄,重复冻解或储存不当。用阳性对照单独检查每种酶(如果使用多种酶)(例如您知道的载体应该给您带来的矢量)。
  • 限制酶通过甲基化阻断(当它们的识别序列甲基化时,一些限制性酶被阻断)。
  • 在不正确的温度下温育酶。使用酶的孵化温度进行双重检查NEB的限制酶图表
  • 使用不相容的缓冲液。NEB的限制酶图表还提供兼容缓冲区的详细信息。某些酶的活性可以在某些缓冲液中降低。当使用多种酶时,您需要确保所有酶都处于使用的缓冲区中的可接受水平。
  • 在反应中,DNA或过多的酶(这产生梯子)。
  • 向量或插入删除。
  • 不完全消化(酶不完全函数)。
  • 已添加或删除限制性站点。
  • 载体准备脏污,可含有抑制消化反应的污染物。如果您关注此,请重新格式化准备(例如MiniPrep)。
  • 酶,高离子强度或高甘油引起的明星活性(明星活性是酶切割Sitath的酶,但不相同,对其标准的切割位点。
  • 克隆实际上是消极的,该死的!

限制屏幕失败的良好做法是用不同的酶组设置另一个摘要。希望您在设计限制屏幕时使您的笔记保持在您可以使用的替代酶。就像没有早晨咖啡的监督员一样,限制屏幕可能很难在时代解释,第二组乐队可以真正帮助解决正在发生的事情。

当克隆在限制屏幕中失败时,重要的是质疑您的数据,并确定您真的知道它是一个负面的。有时显然是阴性克隆实际上是积极的,克隆的众神只是玩硬球(或者有人拔掉你的冰箱并摧毁你的酶而不意识到)。

建立最具信息丰富的消化,并通过上面的清单应该帮助您,可以通过避免重复同样的错误或重新克隆插入时,可以节省宝贵的时间和资源!

您有什么提示用于执行限制屏幕?

最初于2008年8月11日发布。在2020年1月7日更新和修订。

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