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分辨率和折射率:明智地设置你的共焦!

光被棱镜践样,以表示在共聚焦显微镜下优化折射率

任何共聚焦显微镜实验的最重要目标是最大化光子集合。忘记Photons如何返回您的探测器的基础并不是一个坏数据的借口。在本文中,我将向您展示如何通过了解折射率在优化实验方面的重要性来提高图像分辨率。通过审查您设置的一些基本方面,您可以确保您在范围内花费的时间是值得的。

了解折射率

我们都这样做了。我们都在小学中做了一个实验,探索了通过水观看的图像如何移动。这种转变是折射率。当两种不同介质之间的光转换时会发生折射,例如空气和水。折射程度受到若干因素的影响,最重要的是光线通过不同介质的速度。在您的小学实验示例中:通过通过空气越来越慢的光线。折射量相对于这种速度变化。

折射程度也受光的波长的影响。在媒体之间不同的波长折射不同(呈现彩虹)。在几十年来,虽然您已经意识到这种现象,但如果您不优化折射率,您可能不欣赏您的显微镜图像会受到多么遭受。

在优化设置时,您必须考虑特定实验的属性以及这些属性如何影响折射。例如,许多共焦实验涉及大部分由水组成的细胞。由于光留下这些富含富含含水细胞,它可以通过以下不同折射率的任何培养基:油,水,塑料/玻璃,介质/安装介质和空气(参见表格1用于常见折射率)。我们符合所有这些媒体的折射率越好,我们收集高分辨率图像的能力越好。

表1.显微镜中常见培养基的折射率

中等的 折射率
1.33
甘油 1.47
75%甘油 1.44
浸入油 1.51
玻璃 1.52
MoWiol(安装媒体) 1.41-1.49
Vectashield(安装媒体) 1.46
粉底(安装媒体) 1.40
新鲜延长金(安装媒体) 1.39
1天古老的金牌 1.40
4天延长金 1.44

不匹配的折叠索引

那么折射率不匹配的后果是什么?简单地说,不匹配会将您的光子折射到无法识别的地方,导致信息丢失。这导致以下问题:

  1. 球面像差。
  2. 色差。
  3. 降低分辨率。
  4. 减小Z轴中的扫描深度。
  5. 浪费时间和努力。

硬件调整

在较旧的显微镜中,可以调节图像距离以校正通过折射率问题产生的球面像差(改变管长度)。然而,由于其复杂的性质,这种调整通常不是在现代商业共聚焦显微镜上找到。相反,如果您的目标具有校正套环,则有时可以校正由透露盖厚度,非均匀样品或甚至温度变化引起的球形像差。

将受益于校正的最可能条件是高数孔径(NA)目标,其在折射率中具有诸如从空气到玻璃的折射率或水 - 盖玻片中的折射率跳跃。虽然复杂,其他类型的校正器装置存在,例如InfoCus™动态光学聚焦系统。但实际上,调整硬件是最后一个沟渠和昂贵的努力。相反,最好先确保您首先优化您的设置。

优化您的设置

每个实验都不同,需要不同的优化考虑因素。但是,如果您计划使用高NA目标(高于40倍的放大率)并且想要可视化深度结构,或者被弱分辨率挑战,请通过此列表检查以优化您的设置:

1)了解您的目标

您的目标有丰富的信息,包括:

  • 最佳盖玻片厚度;
  • 无论是水还是浸泡镜头;
  • 如果目标有纠正衣领。

你的第一步是倾听你的目标的建议。这包括确保为镜头使用正确的油,并非所有油都是一样的。因此,请咨询制造商并将钱花在他们推荐的那个。此外,请记住,温度很大:加热油可以改变其折射率,加热水可能使其蒸发。如果您可以访问直立的共焦,请考虑浸渍镜头 - 通过消除实时成像中的盖玻片需要使您的生活更轻松。

2)选择合适的盖玻片/腔室

盖玻片厚度的轻微变化可以产生很大的差异。许多目标刻有0.17毫米的最佳盖玻片厚度。但是,由于您的细胞/标本与盖玻片不满,您必须考虑此距离。因此,最多使用盖玻片厚度为0.13-.016mm。(有疑问咨询您的“范围”的技术代表。)

但是,即使您购买了适当厚度的盖玻片,仍然可能会发生轻微的厚度变化,这可能会显着影响您的图像。确保您总是购买高质量的盖玻片,如果您的目标有纠正衣领,请使用它。

与盖玻片一样,重要的是确保用于实时成像的腔室是针对您的目标进行的。在这些情况下,您的细胞通常与玻璃/塑料齐平,因此玻璃的厚度更优选为0.17mm。还采用类似玻璃的折射率制造塑料室。再次记住,可能需要进行故障排除项,不同的目标和不同的菜肴。

3)选择右安装介质

不可避免地,安装介质位于固定标本和盖玻片之间。为标本和荧光团选择最佳安装介质非常重要(见表1)。同样重要的是要确保它足够新鲜以按预期工作,并且您已经考虑到安装后的时间,因为许多安装介质将随时间改变折射率(固化)。

4)调整样品异质性

即使在尝试优化您的目标,盖玻片和安装媒体之后,您仍可能存在问题。不可避免地,您将在您的样本中遇到可变性,将抛出分辨率:安装介质中的气泡,盖玻片厚度的变化,安装介质的深度的变化,或者在完美的细胞上的指甲油的意外涂抹。处理这些问题的最佳方法是首先使用良好的技术尽量减少它们,并尝试用校正项圈纠正不可避免的问题。

我们希望本文有用,并帮助您了解您实验中折射率的重要性。如果捕获更好的共焦图像是您的目标,请务必查看我们的提高共焦图像的前7个提示

最初发布于2015年1月24日。2021年2月2月24日审查和更新。

光被棱镜践样,以表示在共聚焦显微镜下优化折射率

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