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了解您的常见反应试剂

了解您的常见反应试剂

当我第一次开始在实验室开始时,我曾经遵循所有协议给信。现在,只要你的反应顺利运行,这很好。但是,当我有一个新的协议时,我就会出现,我只是无法让它工作。我的主管告诉我只是在我得到的参数中“游戏”。

说得更容易说,因为我知道反应如何理论上的工作,但我没有任何Clue我的议定书中的大部分试剂实际上是什么。我应该怎么取出?什么添加?我完全迷失了。

从那以后,我习惯了仰望我不知道的反应的所有化合物。因此,如果你是类似我的,只有你从来没有到过过检查那些化学品,或者你刚刚在实验室里刚刚开始,这个列表可能对你有用。

DMSO(二甲基磺砜)

DMSO将其生命作为木材行业的副产品,但从那里已成为一种广泛使用的有机溶剂。在实验室中,可以在许多地方发现,例如PCR混合物的一部分,其中有助于展开DNA和引物的二次结构。这里有助于通过聚合酶对引物和伸长的退火。以相同的方式可以将DMSO添加到反转转录混合物中以帮助展开RNA结构。在这些情况下DMSO的替代方案是甜菜碱,这也有助于展开核酸。

DMSO也用于细胞培养物,在那里用作冷冻保护剂(听起来像星球大战的声音不是它吗?)。这简单意味着DMSO将在冷冻过程中保护细胞。当冷冻细胞的主要危险是细胞内的水将冻结并形成冰晶。这些晶体不仅有可能伤害细胞的尖锐尖端,而且还有其冷冻形式的水将占据其液态的水的空间。这意味着细胞内的冷冻水将膨胀并且最终可能最终爆炸细胞。这种灾难可以通过冷冻保护剂(如DMSO)预防(或甘油)。冷冻保护剂将渗透细胞并置换水,从而保护细胞免受冻伤。

无论您使用DMSO,都知道它可以轻松穿透您的皮肤。DMSO本身不是问题,但它将接受任何化学代理,它恰好与之接触。当您希望某种药物渗透到细胞中时,这方便了。但在一个实验室里,你的皮肤下面有很多东西,所以在使用DMSO时始终使用手套。

DTT(Dithiothreitol)

William Wallace克兰尔是第一个描述DTT减少蛋白质中二硫键的潜力的潜力(这就是为什么DTT有时仍称为克兰尔的试剂)。但为什么人们希望首先减少二硫键?

许多蛋白质(甚至DNA)具有游离(未结合的)巯基(-SH)基团。这些未绑定的群体具有与其他未结合的群体互动的倾向,这些群体将导致总体形成。简而言之,你的蛋白质形成肿块并变为不活跃。

DTT将与蛋白质的自由分组相互作用,从而防止其与其他蛋白质相互作用。结论:DTT将稳定您的蛋白质并保持在主动构象中。

DTT的问题是它需要pH为7或更高的pH才能是功能性的,并且它倾向于在空气的存在下氧化(所以将其保持在冰箱中的密封瓶中)。DTT的替代品包括β-巯基乙醇;然而,它只有DTT的降低功率的一半,并且闻起来很可怕。更好的替代方案将是TCEP(TRIS(2-羧基)膦)没有气味的,与DTT一样强大,即使在低于7的pH下也会保持功能。

EDTA(乙二胺四乙酸)

EDTA是所谓的螯合剂。如果你在化学课上得到了注意,你会知道螯合物有一种特殊的与金属离子的结合方式(如果你没有收到注意,你只需要相信我这个)。现在,为什么金属离子对生物学家重要?因为许多酶如DNAse和RNases需要金属离子(例如镁)以便起作用。如果将EDTA添加到您的反应混合,则会耗尽MG2+从而防止所有那些讨厌的人在核酸上啃掉。

但与EDTA一样好,它有其缺点。对于mg.2+不仅需要平均dNase和RNases,而且是由偏心酶,例如连接酶,聚合酶或内切核酸酶。因此,如果在DNA提取中使用EDTA,您可能会发现下游反应的问题,例如连接,PCR或限制性消化。

糖原

与这里的其他物质不同,由于其化学反应性,糖原不会进入实验室,但由于其缺乏反应性(它是惰性的)。实际上,它也不是化学,而是一种多糖(一种糖的形式),其天然由许多动物(包括人类)和真菌产生。在我们的身体糖原中储存在肝脏和肌肉中,它可以转化为葡萄糖以提供能量。所以,如果它是惰性的,它在实验室里做了什么?

通常将乙醇沉淀添加到乙醇沉淀中以增加恢复速率。由于它不是化学活性的,它不会抑制任何下游反应。然而,它将捕获核酸并与它们形成沉淀物。这将为您提供更可见的颗粒,它将有助于您收回少量DNA或RNA。

虽然糖原不是化学活性的,但它可能会干扰蛋白质 - 核酸相互作用。在这种情况下,您可能希望切换到另一个惰性载体(按照调用)。而不是您可能使用的糖原酵母TRNA或者超声处理的DNA,这具有廉价的优点,但它们是生物学活跃的,因此可能导致在下游反应期间出现问题。更昂贵但不太可能干预以后是线性(聚)丙烯酰胺

PMSF(苯基甲基磺酰氟化物)

在蛋白质提取方案中,您通常会发现PMSF。通过特异性结合蛋白酶,胰蛋白酶,胰蛋白酶和凝血酶,抑制诸如胰蛋白酶,胰蛋白酶和凝血酶等蛋白酶的静止的丝氨酸残基来抑制丝氨酸蛋白酶。它还将阻断乙酰胆碱酯酶和硫醇蛋白酶,如木瓜蛋白酶。

PMSF在水中高度不稳定,因此应使用无水液体,例如乙醇,异丙醇或DMSO制备库存溶液。它被认为是高毒性的(想象如果PMSF抑制您体内的蛋白酶会发生什么!)所以在处理它时要小心。

洗涤剂

洗涤剂通常用于溶解疏水蛋白或分解脂质双层,例如细胞膜。离子洗涤剂对其头部组有净电荷,非常有效,但它们会使所有蛋白质联系。

非离子洗涤剂对其头部组没有净电荷,更温和。因此,它们是蛋白质提取的首选,因为它们会分解细胞膜但不使蛋白质提取的蛋白质。

着名的离子洗涤剂是SDS(十二烷基硫酸钠)。它可以溶解细胞,但大多数情况通常用于电泳。它会使蛋白质和完全包膜蛋白质。SDS的负电荷比蛋白质的任何潜在电荷更强大,这就是为什么所有蛋白质在电泳期间将朝向正极迁移到原因。

非离子洗涤剂的实例包括NP40.Triton X-100或者Brij 35.。它们都可以用于溶解细胞而不使细胞中的蛋白质变性。另一种广泛使用的非离子洗涤剂是吐温20(聚山梨醇酯20)。它通常用于蛋白质印迹,其中添加以防止抗体的非特异性结合。

显然这个名单远非详尽无遗,但这些是我遇到了很多的试剂。也许你想添加一些经常出现在你的反应中的化合物 - 如果所以请将它们留在评论中。

4评论

  1. 梅瑟特25. 2019年10月29日下午2:42

    非常感谢,这非常简单,清晰易懂!现在我知道我下次使用这些试剂时我正在做什么!

  2. 但我不是说唱歌手 2018年8月23日凌晨12:29

    漂亮的文章。还原剂的部分有点不完整。值得注意的是,降低药剂如DTT和TCEP也可以与蛋白质中的二硫键反应,而不仅仅是游离硫醇。额外的评论是DTT是Dithiol,BME具有单个硫醇,这并不完全是指DTT是BME的两倍。在减少半胱氨酸二硫键时,DTT是一种多的有效性,其中一种DTT硫醇与半胱氨酸硫醇形成二硫化物,然后存在分子内反应以返回自由胱素硫醇(参见DTT维基百科制品)。对于BME,反应的第二步是分子间的而不是分子内的,因此它的动力学较差,这就是为什么我认为DTT是BME的两倍多。

  3. 创意Animodel. 2015年8月18日上午8:36

    因为许多反应试剂具有相同的颜色,所以使它们难以区分!

  4. 史蒂文里奥斯 2015年6月9日上午9:57

    非常有用,谢谢。

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