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共焦图像:您需要的专家提示!

在共聚焦显微镜上成像的多彩多姿的细胞,以说明您如何改善您的共焦图像

您的共焦图像是否让您带来了需要的东西?也许你认为你的图像很好,但你想知道他们是否会更好?我把一些顶级提示放在一起,让你的共焦图像看起来最好。

1.选择您的X / Y分辨率

还有其他伟大的文章可以阅读在共聚焦显微镜中的分辨率更详细地,但要做一个长话短说,要获得正确的信号,数字化分辨率必须至少是您尝试实现的分辨率的两倍。换句话说,您必须选择采样率(像素密度),使您可以为您提供镜头分辨率的两倍。

共聚焦显微镜软件可帮助您执行此操作。通过为您提供镜头的详细信息,以及您将通过什么样的采样(即1024 x 1024或4096 x 4096像素)来实现的。您应该选择以像素率的像素速率进行样本,使特定镜头为您提供两倍的分辨率(半半)。有些显微镜让你真的懒惰,甚至有“优化分辨率”按钮。这些按钮考虑到镜头,波长,针孔和变焦因子来设置像素比。所有你所要做的就是点击它。

2.选择z步分辨率

类似的考虑适用于Z分辨率。当然,Z中的光学分辨率要少得多,因此您最终需要更少的像素。如果要做3-D重建,Z-投影或形态格术,则应始终使用最佳Z步骤,或者任何细长的结构都将最终看起来像一系列斑点。

3.避免共聚焦图像中的串扰

如何避免同时扫描串扰

这是一个真正的新秀错误:你有两三个染料,例如染料。核的DAPI和两个用于免疫染色,例如488nm(a)和555nm(b)。您有一个漂亮的共焦,至少有三条激励线和三个探测器。您可以应用所有三个染料,扫描和几分钟内的设置。

耶!不仅是你完成的,而且你已经做出了一个突破性的发现:你的蛋白质结合了!事实上,他们将100%结合起来。此外,它们都可以在核和细胞质中看到它们 - 它们填充核!好吧,不要准备诺贝尔接受讲话......你目睹的是串扰(也知道光谱渗透)。

什么是串扰?

简单地说,串扰是当染料A的发射光谱延伸到染料b的检测区域时,你确实可以同时扫描相距很远的染料——比如488 nm和647 nm——但它确实可以避免与相邻染料同时扫描。当然,“邻近”的定义取决于两种染料的光谱和显微镜的灵活性(能够塑造探测窗口是很好的)。

如何避免共聚焦图像中的串扰?

如果您的显微镜允许它,您可以尝试通过将染料B的检测窗口移开染料A的检测窗口来避免重叠。您还可以减少染料A的激励,同时增加励磁和降低检测的增益染料B.

如果您真正消除串扰,则可以执行一件简单的事情:打开一个染料的激励线和另一个染料。你不应该看到任何东西。如果您确实看到了一些东西,您需要使您的条件更严格。

显然,所有这些都有限制。您最终只能使用B的发射光谱的一小部分,并使用太多的电源来激发它,同时,使用太少的染料A的激发,并获得太多的增益来检测它。所以,是的,你将节省时间并避免串扰 - 但你将结束不好的形象和漂白样本。有一种更好的方法来做事情。

如何避免串扰顺序扫描

顺序扫描正是名称所说的:你兴奋A,只有这个染料的窗户打开。然后搅拌染料B,只有其窗户打开。然后c和d如果你愿意的话。你每次激发每种染料,一次只打开一个窗口。顺序扫描,如此处理颜色的正确空间注册 - 您所要做的就是设置它。

顺序扫描是扫描多彩色样本的最佳最安全的方法。但是,当然,即使用连续扫描,你也可以搞砸,如果你真的试试。例如,如果您的检测窗口是灵活的,则可以决定使窗口更大,以便您有更多的收益。这完全很好,只要你没有开始收集来自错误染料的数据!

如果您想知道在没有令人兴奋的情况下会发生这种情况,答案很简单:当我们激发一定的染料时,我们使用最佳激发波长 - 不是唯一的激发波长!染料在特定波长下没有激发“开/关开关”;它们具有激励频谱。所以当令人兴奋的染料A时,你也可能是令人兴奋的染料B - 依从错误的波长 - 但令人兴奋的是。如果没有您实现它,所有这一切都会发生,因为所有信号都会看起来相同的颜色 - 您已分配为颜色的颜色!

4.确保两个信号在你的共焦图像中真正的共域化

好的,你已经建立了绿色真正绿色,红色真的是红色,没有录制串扰。但是当你看到你的共聚焦图像中的黄色时,它是否真的是结冰的?不必要!这个主题可以说很多。但这是要记住的重要提示:

不要在折叠堆栈(投影)中寻找定位。始终关注堆栈的各个部分,或者更好的是,关注堆栈的正交部分。

5.控制振动

如果有人在显微镜扫描时走进你的共焦室,并且你看到屏幕上的线条,那么有些东西是错误的。通常,您应该能够在没有问题的情况下上下跳跃,因为共聚焦显微镜通常位于抗振动表上。

最好的是空气悬浮液,可以将显微镜与地板上的任何振动完全分离。但是,当然,它无法帮助其他振动来源 - 从通风/空调系统中说空气流。

理想情况下,通风系统应定制成像室,摄入量非常大的摄入和流出区域(整个天花板是流出的最佳选择),可以提供大量的空气转换,但空速非常低。还保持21左右的稳定温度O.C是非常重要的,所以一个人不能在热交换上削减角落。

6.应对冷凝

你的幻灯片看起来像一杯啤酒吗?如果你刚刚把你的样品带出冰箱,你迫不及待想要想象它们......好吧克服它。您需要确保首先将它们带到室温。将透镜油与冷凝液滴混合将阻止您在共聚焦图像中实现最佳分辨率。

7.在屏幕上修复奇怪的幽灵

在屏幕上看到奇怪的线条?不,尚未安排修复。也许它只是你的手机太近显微镜!虽然这仅影响某些类型的探测器,但它需要考虑。

我希望这些提示可以帮助您获得最佳的共聚焦图像。有自己的秘诀吗?请务必在下面分享。

最初发布于2015年5月14日。2021年2月14日审查和更新。

在共聚焦显微镜上成像的多彩多姿的细胞,以说明您如何改善您的共焦图像
图像信用:Caleb Foster

3评论

  1. bob体育是赌钱的吗 2016年2月3日上午7:00

    [...]您是一个共聚焦超级用户或荧光显微镜新手,标记您的细胞的过程仍然是[...]

  2. bob体育是赌钱的吗 2015年12月16日上午7:00

    [...]Based on my own area of research, the first example that springs to mind is the study of the immunological synapse—in other words, investigating what’s going on when an immune cell (like a T cell or an NK cell) interacts with a target cell. Even with the high-tech microscopes available today, it is really difficult to study cell-cell interactions at high resolution because of the orientation of the cells (they can be facing in any direction) and the depth at which you have to image (even if one cell was conveniently sitting right on top of the other). On the other hand, if a cell lands on a flat lipid bilayer, it becomes really easy to observe protein interactions at the cell-bilayer interface, even by confocal microscopy. […]

  3. bob体育是赌钱的吗 2015年12月1日上午7:15

    [...]您可以在宽场荧光和共聚焦显微镜的帮助下监测生活系统中的蜂窝过程。这对其他标记有利,这可能需要您添加用于检测的基板以[...]

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