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使用双Delta Ct分析qPCR数据的4个简单步骤

手指“行走”的木块排列成步骤,代表步骤Ct值从qPCR实验,分析双delta Ct分析

你在机场忙着写明早要交给教授的报告,浪费时间。你有你的数据。为什么不利用这段时间来计算你测试过的基因的表达倍数变化呢第一次qPCR实验你上周做了吗?

这很容易——我来教你怎么做。

检查你的方法

qPCR数据分析主要有两种方法:双delta Ct分析和相对分析标准曲线法(Pfaffl方法)。这两种方法都有假设和局限性,所以您应该使用的分析方法将取决于您的实验设计。

双delta Ct分析假设:

  • 各引物组间引物效率相等(即在5%以内);
  • 内参基因与靶基因扩增效果接近100%;
  • 内部控制基因不断表达,不受治疗的影响。

该方法一般适用于需要大量DNA样本和少量基因测试的实验。

相对标准曲线法假设:

  • 控制样品和处理样品之间的效率是相等的。

如果你的DNA样本较少,但要测试的基因数量较多,这种方法效果更好。

双Delta Ct分析需要什么

  • qPCR Ct值(原始数据):
    • 管家基因:控制和实验条件;
    • 感兴趣的基因:控制和实验条件;
  • 一个Excel电子表格。

这是它!不需要昂贵的软件。

以下是对双三角Ct分析关键步骤的快速总结(详细说明)读这篇文章).

双Delta Ct分析的4个步骤

1.取管家基因和在实验和控制条件下测试的基因的Ct值的平均值,返回4个值。这4个值分别是实验基因检测(TE)、对照基因检测(TC)、管家实验基因检测(HE)和管家基因控制(HC)。

平均实验Ct价值 平均实验Ct价值 平均控制度t价值 平均控制度t价值 Ct值(实验) Ct值(控制)
TE TC HC CTE CTC
21.27 20.23 19.60 19.27 1.03 0.33

2.计算实验值(TE - HE)和控制值(TC - HC)之间的差异。这些是你的实验(CTE)及管制(CTC)条件,分别。

3.然后,计算两者的差值实验和控制条件下的CT值(CTE -得到双三角Ct值(ddCt)。

4.因为所有的计算都是以2为底的对数,所以每次DNA数量增加一倍,你的Ct值就会减少1,而不会减半。你需要计算2的值^{2 \ \δC_ {t}}来得到表达式fold的变化。

dCt值(实验) dCt值(控制) ddCt价值 表达褶皱变化
dCTE dCTC ddCt 2 ^ -ddCt
1.03 0.33 0.70 0.615572207

这个值是什么意思?

现在你有了折变的值,它到底是什么意思呢?这个值是你感兴趣的基因在测试条件下相对于控制条件的折数变化,这已经被归一化到你的管家基因。

为了更清楚一点,你可以把它看成一个百分比。1倍的变化意味着你的测试条件下的基因表达量和你的控制条件下的基因表达量是100% -所以实验组和对照组之间没有变化。倍数变化值大于1表示感兴趣基因相对于对照表达上调(1.2倍变化= 120%基因相对于对照表达,5 = 500%,10 = 10000%等)。值小于1表示基因相对于对照下调(fold change 0.5表示基因相对于对照表达50%,相当于对照表达的一半,等等)。

您可以将这些数据显示为折线变化条形图,将控制条件绘制为1。你也可以使用统计分析来检查变化的重要性,例如使用方差分析(ANOVA)或t-测试,任何适合您的实验设置!

使用这些步骤,您可以在任何地方进行qPCR分析,即使您是在公路旅行。为了使事情更简单,您可以创建一个Excel模板来每次使用。然后你只需要输入你的数据,你将会以你在进行分析时的敏捷性让别人惊讶!

最初发表于2016年7月9日。于2021年2月8日进行审核和更新。

进一步的阅读

Livak KJ, Schmittgen TD。利用RealTime定量PCR技术分析相关基因表达数据^{2 \ \δC_ {t}}方法。方法。2001;25: 402 - 8。

手指“行走”的木块排列成步骤,代表步骤Ct值从qPCR实验,分析双delta Ct分析

51条评论

  1. Dhafer Al-koofee 2020年1月8日晚上7点49分

    这是一个很好的解释,也很容易应用,但是没有固定的作用,例如有人说,如果fold change小于one,意思是下调,反之亦然,当fold change等于1时,表达没有区别。有些时候,人们对双三角Ct值产生了分歧,我认为这让很多研究人员感到困惑。然而,Livak方法只适用于印度政府和香港的效率相似或需要5%的情况。而delta Ct可以应用于单个样本,有利于细胞系和Livak的应用,因为delta Ct方法是Livake的变体,而Pfaffi方法用于不等于或接近GOI和HKG的效率。
    我建立了一个单独的Excel表格来处理不平均的实验和控制。



  2. 默罕默德 2019年3月12日下午4:05

    我想问你为什么在2^-ΔΔCt中加上(-)当你计算=2^(- o4)时当你在excl中计算时,你应该放负号吗?如果ddCt值为正,则相关基因上调,因为fold change将大于1。另一方面,如果ddCt为负值,则该基因下调,fold change <1。所以删除-你会得到0.1倍的变化,但我真的不知道我怎么能说这个基因下调了0.1倍的变化?



    • 拉蒙 2019年6月27日下午1:20

      你需要在2^-ΔΔCt中保留负号。如果表达式为负数,则该方程将检索一个小于1的值。

      如果“Expression Fold Change”或“RQ”的值低于1,这意味着你有一个负的Fold Change。为了计算负值,你需要将RQ数据转换为Excel中的公式:

      =如果(> = 1,X (1 / X) * (1))

      将“X”更改为RQ数据的单元格。在示例的Excel中,单元格为“P4”,因此:

      =如果(P4 > = 1, P4, (1 / P4) * (1))

      这样,如果数字是1或>1,没有变化,但如果数字是<1,你将有负折叠变化。在您的示例中,如果值为0.1,您将检索-10倍的变化,并且您将能够说:“我的RQ是0.1,这意味着我们的表达式比我们的控制人口低10倍”。

      对我来说,以这种方式转换RQ数据更容易,以获得更好的数据图形表示(更直观的表示)。希望这能澄清你的顾虑!



  3. 默罕默德 2019年3月12日下午3:53

    嗨,你能告诉我为什么很多人用曲线图来表示折数变化,他们在曲线图上放了负值,例如他们把基因下调了,调节到-10,但是当他们讨论时,他们说这个基因上调了10倍,你能给我解释一下吗。我的意见,根据你的excel表格,我只能说基因下调了-4.13倍变化17.5,这是正确的解释方式吗?



    • Sadia纳齐尔 2019年7月1日下午1时43分

      这不是fold change的情况。折叠的变化是0.1 0.001 0.002 0.000000007等等,负的是delta delta ct。在科学上,delta - delta ct图比fold change更有意义。然而,当我们开始做减法计算时,作为兴趣基因的ct基因,作为家庭保持基因,这里的delta ct值与dna或rna的数量成反比。所以ct越少,量越大。所以一个负值意味着更高的监管。但是如果你做ct减法,像参考基因,感兴趣的基因比δ ct将直接与起始材料的数量成比例,这更有意义。



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