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使用双倍ΔCT分析来分析QPCR数据的4个简单步骤

手指“走路”向上被安排为步骤,代表来自QPCR实验的CT值中的步骤,通过双倍ΔCT分析分析

您在机场燃烧时间与明天早上为您的教授的报告。你有你的数据。为什么不利用时间并计算您在该测试中的基因的表达式折叠变化第一个QPCR实验你上周做了吗?

这很简单 - 我会告诉你如何。

检查你的方法

分析QPCR数据有两种主要方法:双倍ΔCT分析和相对标准曲线方法(Pfaffl方法)。这两种方法都做出了假设并具有它们的局限性,因此您应该使用的方法将取决于您的实验设计。

双倍ΔCT分析假定:

  • 底漆组之间存在相等的引物效率(即5%以内);
  • 参考文献和靶基因接近100%扩增效果;
  • 内部对照基因不断表达,并且不受治疗的影响。

该方法一般达到大量DNA样品的实验和待测试的少量基因。

相对标准曲线方法假定:

  • 对照与治疗样品之间存在相同的效率。

如果您有更少的DNA样本,但是较多的基因进行测试,这种方法可以更好地效果更佳。

您需要什么双倍ΔCT分析

  • QPCR CT值(原始数据):
    • 家务基因:控制和实验条件;
    • 感兴趣的基因:控制和实验条件;
  • Excel电子表格。

那就是它!不需要昂贵的软件。

以下是双倍ΔCT分析中的关键步骤的快速摘要(用于详细说明阅读本文)。

双倍ΔCT分析的4个步骤

1.以实验和对照条件,在实验和对照条件下测试内政基因的CT值的平均值,返回4个值。4个值是被测试的基因进行实验(TE),基因被测试对照(TC),内脏基因实验(HE),以及家务基因对照(HC)。

平均实验C.T.价值 平均实验C.T.价值 平均控制C.T.价值 平均控制C.T.价值 \三角洲CT.价值(实验) \三角洲CT.价值(控制)
te. TC. HC. \三角洲CTE. \三角洲CTC.
21.27 20.23 19.60 19.27 1.03 0.33

2.计算实验值(TE - HE)与控制值(TC - HC)之间的差异。这些是你的\三角洲实验的CT值(\三角洲CTE)和控制(\三角洲CTC)条件分别。

然后,计算之间的差异\三角洲实验和控制条件的CT值(\三角洲CTE -\三角洲CTC)到达Double Delta CT值(DDCT)。

4.由于所有计算都处于对数基础2,因此每次都有两倍多的DNA时,CT值都会减1并且不会减半。您需要计算2的值^ { - 2 \ delta \ delta c_ {t}}获得表达式折叠更改。

DCT值(实验) DCT值(控制) DDCT值 表达折叠变化
DCTE. DCTC. DDCT. 2 ^ -DDCT.
1.03 0.33 0.70 0.615572207.

价值是什么意思?

现在你有你的折叠变化的价值,它实际上是什么意思?该值是对测试条件的感兴趣基因的折叠变化,相对于控制条件,这一切都被标准化为您的家务基因。

要使它更清晰 - 您可以将其视为百分比。折叠变化1表示您在控制条件下的测试条件中有100%的基因表达 - 因此实验组和对照组之间没有变化。高于1的折叠变化值显示相对于对照的利益基因的上调(1.2倍变化= 120%基因表达相对于对照,5 = 500%,10 = 1,000%等)。低于1的值指示相对于对照的基因下调(折叠变化0.5是相对于对照的50%基因表达,因此在对照中的一半表达如下)。

您可以将这些数据呈现为折叠更改条形图,将控制条件绘制等于1.您还可以使用统计分析来检查变化的重要性,例如,使用方差分析(ANOVA)或T.- 最低,无论是适合您的实验设置!

使用这些步骤,您可以随时随地进行QPCR分析,即使您正在进行公路旅行。要使事情更轻松,您可以创建每次使用Excel模板。然后,您只需要输入您的数据,并且您将在进行分析时令人惊讶的是其他人!

最初发布于2016年7月9日。2021年2月8日的审查和更新。

进一步阅读

Livak KJ,Schmittgen TD。使用实时定量PCR和2的相对基因表达数据分析^ { - 2 \ delta \ delta c_ {t}}方法。方法。2001;25.:402-8。

手指“走路”向上被安排为步骤,代表来自QPCR实验的CT值中的步骤,通过双倍ΔCT分析分析

51评论

  1. Dhafer al-Kofee 2012年1月8日,下午7:49

    它是一个很好的解释和易于应用,但是没有完成固定的角色,例如,如果折叠变化的话说,如果折叠相对于折叠变化的表达没有差异,则说明折叠变化不到一个折叠变化。当折叠变化时,表达式没有差异一。一段时间分开在双倍ΔCT值上,我认为这对许多研究人员困惑。然而,仅当GOI和HKG的效率相似或彼此需要5%时才应用了LIVAK方法。虽然Delta CT可以应用于单个样品,并且对于细胞系应用以及Livak,并且ΔCt方法除了用于非等于或接近Goi和HKG的效率的PFaffi方法之外,Delta CT方法还具有对Livake的变化。
    最好的问候,我建立了一个塞克拉特的Excel协议,而不是实验和控制的平均值。



  2. 穆罕默德 2019年3月12日在下午4:05

    我想问你为什么在你计算时计算= 2 ^( - o4)时,你会在2 ^-ΔΔct中添加( - )。这就是为什么你折叠改变17.5我认为这是错误的,因为如果DDCT有正价值,则上调感兴趣的基因,因为折叠变化将大于1.另一方面,如果DDCT有负数值,下调基因并折叠变化<1。所以删除 - 你会得到0.1倍的变化,但我真的不知道如何说这个基因在0.1倍的变化中下调?



    • Ramón. 2019年6月27日下午1:20

      您需要保持2 ^-ΔΔct中的负面。如果具有否定表达式,则该等式将检索低于1的值。

      如果“表达式折叠变化”或“RQ”的值低于1,这意味着您具有负折叠变化。要计算负值,您需要在Excel中使用此等式转换RQ数据:

      = if(x> = 1,x,(1 / x)*( - 1))

      将“X”更改为RQ数据的单元格。在excel中,它将是小区“p4”,因此:

      = if(p4> = 1,p4,(1 / p4)*( - 1))

      那种方式如果数字是1或> 1,没有任何更改,但如果数字<1,则将具有负折叠变化。在您的示例中,如果该值为0.1,则将检索-10折叠变化,并且您将能够说:“我的rq是0.1,这意味着我们的表达率低于我们的控制群。

      对我来说,更容易改变这种方式来具有更好的数据的图形表示(更直观的表示)。希望这可以澄清你的疑虑!



  3. 穆罕默德 2019年3月12日在下午3:53

    嗨,请你能告诉我为什么很多人做了折叠变化的图表,并且他们把负值放在他们把基因下调的图表中置于-10但是当他们讨论时,他们表示,他们说这个基因是upregulatd 10折来解释10折我。我的看法根据你的Excel表我只能说,基因是下调-4.13折叠变化17.5是正确解释的方法吗?



    • Sadia Nazir. 2019年7月1日下午1:43

      因此,不变的情况并非如此。折叠变化使得0.1,0.001,0002,000000007等。否定是delta delta ct。和达达达达克斯CT GRPAHS比折叠变化更有意义。然而,正如我们开始减法的计算作为感兴趣的CT House保持基因的CT基因,这里的DELTA CT值与DNA或RNA的量成反比。所以较小的CT更多的金额。因此,负值意味着规定。但是,如果你做的CT减法,比如利息的参考基因,比Delta CT将与更有意义有意义的起始材料的量成正比。



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