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使用双倍ΔCT分析来分析QPCR数据的4个简单步骤

手指沿着木块“行走”,木块排列成台阶,代表qPCR实验的Ct值,通过双delta Ct分析

你在机场忙着给你的教授写明天早上要交的报告。你有你的数据。为什么不利用这段时间计算你测试过的基因的表达倍数变化呢第一个QPCR实验你上周做了吗?

这很简单 - 我会告诉你如何。

检查你的方法

qPCR数据的分析主要有两种方法:双delta Ct分析和相关分析标准曲线方法(Pfaffl方法)。这两种方法都做了假设并有其局限性,所以你应该使用的分析方法将取决于你的实验设计。

双倍ΔCT分析假定:

  • 底漆组之间存在相等的引物效率(即5%以内);
  • 参考基因和目的基因扩增率接近100%;
  • 内部对照基因不断表达,并且不受治疗的影响。

这种方法通常适用于使用大量DNA样本和少量基因进行测试的实验。

相对标准曲线法假设:

  • 对照与治疗样品之间存在相同的效率。

如果你有更少的DNA样本,但是有更多的基因来测试,这种方法会更好。

你需要双Delta Ct分析

  • QPCR CT值(原始数据):
    • 家政基因:控制和实验条件
    • 感兴趣的基因:控制和实验条件;
  • Excel电子表格。

那就是它!不需要昂贵的软件。

以下是双倍ΔCT分析中的关键步骤的快速摘要(用于详细说明读这篇文章)。

4步双Delta Ct分析

1.以实验和对照条件,在实验和对照条件下测试内政基因的CT值的平均值,返回4个值。4个值是被测试的基因进行实验(TE),基因被测试对照(TC),内脏基因实验(HE),以及家务基因对照(HC)。

平均实验Ct价值 平均实验Ct价值 平均控制C.t价值 平均控制C.t价值 Ct值(实验) Ct值(控制)
TE TC HC CTE. CTC.
21.27 20.23 19.60 19.27 1.03 0.33

2.计算实验值(TE - HE)与控制值(TC - HC)的差异。这些是你的实验Ct值(CTE)和控制(CTC)条件,分别。

然后,计算之间的差异实验和控制条件的CT值(CTE -CTC),以得到双delta Ct值(ddCt)。

4.因为所有的计算都是以2为底的对数,每次有两倍的DNA,你的Ct值就会减少1,不会减半。你需要计算2的值^{2 \ \δC_ {t}}得到表达式的变化倍数。

DCT值(实验) dCt值(控制) ddCt价值 表达褶皱变化
DCTE. DCTC. DDCT. 2 ^ -ddct.
1.03 0.33 0.70 0.615572207

这个值意味着什么?

现在你有你的折叠变化的价值,它实际上是什么意思?该值是对测试条件的感兴趣基因的折叠变化,相对于控制条件,这一切都被标准化为您的家务基因。

为了更清楚一点,可以用百分数来表示。1的倍数变化意味着在你的测试条件下,基因表达量是在你的控制条件下的100%,所以实验组和对照组之间没有变化。倍数变化值大于1表示相关基因相对于对照上调(1.2倍变化= 120%基因相对于对照表达,5 = 500%,10 = 10000%等)。值低于1表示基因相对于对照的下调(0.5倍的变化是基因相对于对照的50%表达,所以是对照的一半表达,等等)。

您可以将这些数据呈现为折叠更改条形图,将控制条件绘制等于1.您还可以使用统计分析来检查变化的重要性,例如,使用方差分析(ANOVA)或t- 最低,无论是适合您的实验设置!

使用这些步骤,你可以进行你的qPCR分析,无论你在哪里,即使你在一个公路旅行。为了使事情更加简单,您可以创建一个Excel模板每次使用。然后你只需要输入你的数据,你就会以你敏捷的分析让别人大吃一惊!

最初发表于2016年7月9日。更新于2021年2月8日。

进一步的阅读

liak KJ, Schmittgen TD。使用实时定量PCR和2的相对基因表达数据分析^{2 \ \δC_ {t}}方法。方法。2001;25: 402 - 8。

手指沿着木块“行走”,木块排列成台阶,代表qPCR实验的Ct值,通过双delta Ct分析

51条评论

  1. Dhafer Al-koofee 2012年1月8日,下午7:49

    它是一个很好的解释和易于应用,但是没有完成固定的角色,例如,如果折叠变化的话说,如果折叠相对于折叠变化的表达没有差异,则说明折叠变化不到一个折叠变化。当折叠变化时,表达式没有差异一。一段时间分开在双倍ΔCT值上,我认为这对许多研究人员困惑。然而,仅当GOI和HKG的效率相似或彼此需要5%时才应用了LIVAK方法。虽然Delta CT可以应用于单个样品,并且对于细胞系应用以及Livak,并且ΔCt方法除了用于非等于或接近Goi和HKG的效率的PFaffi方法之外,Delta CT方法还具有对Livake的变化。
    最好的问候,我建立了一个塞克拉特的Excel协议,而不是实验和控制的平均值。



  2. 穆罕默德 2019年3月12日下午4:05

    我想问你为什么在你计算时计算= 2 ^( - o4)时,你会在2 ^-ΔΔct中添加( - )。这就是为什么你折叠改变17.5我认为这是错误的,因为如果DDCT有正价值,则上调感兴趣的基因,因为折叠变化将大于1.另一方面,如果DDCT有负数值,下调基因并折叠变化<1。所以删除 - 你会得到0.1倍的变化,但我真的不知道如何说这个基因在0.1倍的变化中下调?



    • 拉蒙 2019年6月27日下午1:20

      您需要保持2 ^-ΔΔct中的负面。如果具有否定表达式,则该等式将检索低于1的值。

      如果“Expression Fold Change”或“RQ”的值小于1,这意味着你有一个负的Fold Change。为了计算负值,你需要使用Excel中的这个公式来转换RQ数据:

      =如果(> = 1,X (1 / X) * (1))

      将“X”更改为RQ数据的单元格。在本例的Excel中,它将是单元格“P4”,因此:

      =如果(P4 > = 1, P4, (1 / P4) * (1))

      那种方式如果数字是1或> 1,没有任何更改,但如果数字<1,则将具有负折叠变化。在您的示例中,如果该值为0.1,则将检索-10折叠变化,并且您将能够说:“我的rq是0.1,这意味着我们的表达率低于我们的控制群。

      对我来说,更容易改变这种方式来具有更好的数据的图形表示(更直观的表示)。希望这可以澄清你的疑虑!



  3. 穆罕默德 2019年3月12日下午3:53

    嗨,请你能告诉我为什么很多人做了折叠变化的图表,并且他们把负值放在他们把基因下调的图表中置于-10但是当他们讨论时,他们表示,他们说这个基因是upregulatd 10折来解释10折我。我的看法根据你的Excel表我只能说,基因是下调-4.13折叠变化17.5是正确解释的方法吗?



    • Sadia Nazir. 2019年7月1日下午1:43

      所以这不是折叠变化的情况。折痕变化像0。1 0。001 0。002 0。00000007等等,负数是delta delta ct。而delta delta ct图比折叠改变更有科学意义。然而,当我们开始计算做减法的ct基因的兴趣-ct保留基因,这里的delta ct值是成反比的dna或rna的数量。ct越小,量越大。负值意味着监管力度加大。但是如果你像参照基因那样做ct减法,那么ct将直接与起始物质的数量成正比,这更有意义。



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