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你的约束力有多强?快速介绍等温滴定量热法

你的约束力有多强?快速介绍等温滴定量热法

什么是等温滴定量热法?

等温滴定量热法(ITC)测量一种溶液被滴定到另一种溶液中所产生(或吸收)的热量。通常情况下,小分子或肽被滴定成蛋白质。如果分子与蛋白质结合,每次注射都会放出热量(或吸收热量),直到蛋白质饱和。1然后可以分析这个结合曲线(图1),找到解离常数(Kd摩尔自由能变化(δ g)、摩尔焓变化(δ h)、摩尔熵变化(δ s)和蛋白质-配体结合作用的化学计量学。

你的约束力有多强?快速介绍等温滴定量热法

图1

整个过程完全无需干预:用汉密尔顿注射器手动将含有蛋白质的“细胞”装入;按一下按钮,从PCR管中装入滴定注射器;剩下的就由自动化控制软件来处理了。一个典型的实验需要2 - 3个小时(从初始设置到输出Kd)。

等温滴定量热法的用途是什么?

有很多方法可以使用ITC。你可以测试蛋白质突变如何影响配体结合,以找到疾病突变影响的可能分子原理。你可以得到小分子(或多肽或DNA!)和它们的目标酶的结构亲和关系。你可以使用竞争实验来观察抑制剂是否与特定的底物竞争。所有这些都依赖于Kd但是化学计量学也很有用:比较配体的理论和实验化学计量学值,就可以得出正确折叠蛋白质的百分比。这些是一些常见的用法,但绝不是一个详尽的列表!

与其他技术相比,使用等温滴定量热法有什么好处?

ITC的独特卖点是没有标签或固定不同于表面等离子体共振(SPR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等技术。这意味着不需要担心标签或固定表面模糊了生物相关的相互作用。

其次,从纳米摩尔到毫摩尔的亲和力(理论上)可以量化。修改实验以适应不同的亲和度通常是简单的,尽管存在一些实际的限制,如溶解度(弱相互作用的问题)和信噪比(确定K时的问题)d强烈的相互作用)。第二个限制听起来可能有悖直觉,但这是需要一个s型滴定曲线的结果。配体亲和力的范围,可测量的一个特定的蛋白质可以扩大使用竞争实验

一个广泛的缓冲器被容忍(尽管有些比其他要好)。如果你的蛋白质需要一个特定的pH值或添加剂来阻止它沉淀,或者你想测试pH值、离子强度或金属离子(举几个例子)的变化如何影响结合相互作用,这可能变得很重要。由于不需要特殊的添加剂或试剂,进行实验的成本非常低——所需要的只是使它们溶解和稳定的缓冲液中的配体和受体。2

关于ITC的另一件伟大的事情是KdG,ΔH,ΔS和化学计量可以在一次实验中确定3.这是几个小时的实验得来的大量信息。甚至可以提取多个结合常数(如果蛋白质有两个不同K的配体结合位点)ds)从一次(精心计划的)滴定。

ITC可以做动力学,太。酶反应动力学配体结合动力学两者都可以研究。这些方法可用于确定酶的稳态动力学参数和配体结合的速率常数。

等温滴定量热法的缺点

当然,在某些情况下,替代技术更为合适。

ITC的第一个关键缺点是低吞吐量。一次只能检测一种配体,(如上所述)每次滴定至少需要3小时。存在自动化系统(参见在这里在这里),但考虑到细胞装载的繁琐性质,我个人很不愿意把我宝贵的蛋白质样品交给自动化系统!

ITC的第二个主要问题是,与荧光偏振、热位移和ELISA等低体积技术相比,ITC使用了大量的蛋白质。

由于这两个原因,ITC显然不适合筛选大量配体(例如在药物发现的背景下)。如果蛋白质或配体的可用性非常有限,这也是不可行的(见下文)。

听起来太棒了!我可以试试我的蛋白质/配体吗?

简而言之,(可能)是的!

原则上,ITC可用于描述任何涉及产生或吸收热量的相互作用或过程。

我猜对大多数人来说,最困难的一步是找到一个他们可以使用的量热计(它们既昂贵又精致,所以你可能不得不友好地请求!)如果你足够幸运可以接触到一个,你可能需要比其他结合分析更多的蛋白质。根据K的不同,确切的数量会有很大的变化d和相互作用的δ h(见表1)。如果你不知道你的结合作用有多强,那么通常推荐的起点是30µM细胞浓度和300µM注射器浓度。对于30 kDa蛋白和200细胞体积µL(这是Malvern的Peaq和ITC200模型和TA仪器的低体积纳米ITC的标准),这意味着需要270µg蛋白。4这些仪器需要配体体积为80µL,因此配体-蛋白滴定需要0.024µmol,配体-缓冲液控制实验需要0.024µmol。

表1

预期Kd 推荐细胞蛋白 所需蛋白质质量(假设MW = 30 KDa,填充细胞所需300µL)
0.1µM 1µM 9µg
1µM 10µM 90µg
10µM 100µM 900µg

网上有大量关于实验设计、故障排除和克服已知实验局限性的信息(我建议全部的ITC初学者使用)这些幻灯片作者是来自马尔文的彼得·吉梅森。每台机器附带的手册也很有帮助)。

脚注

1当然,有一长串的理由可以说明这可能不会发生!

2免责声明:这是真的,但更常见的是需要一些“试验”滴定来找出最佳条件。

3.滴定池是由Hastelloy®。可以找到一些关于推荐缓冲区的有用信息在这里

4对于200µL的细胞体积,由于汉密尔顿注射器和样品细胞的茎部的死体积,需要~300µL来填充细胞。

图片来源:freepik

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