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T4 DNA Ligase:你需要的唯一的Ligase?

T4 DNA Ligase:你需要的唯一的Ligase?

DNA连接酶包括分子生物学动力工具T4 DNA连接酶,是通过催化形成的促进DNA链的酶促酶5'-PO之间的磷酸二酯债券4.和3'-OH群体DNA的骨干。在生物体中,DNA连接酶在修复在复制和损伤期间的DNA中的破裂中起重要作用,从而确保了遗传信息的完整性。

发现DNA连接酶

鉴于他们在DNA修复和复制中的重要作用,提出了甚至在发现之前存在细胞中的DNA连接酶活性。两个观察结果刺激了DNA连接酶的搜索。

  1. DNA分子破裂和再加工的遗传重组发生。
  2. 感染后,通过噬菌体DNA形成闭合圆圈。

1967年,DNA连接酶被独立发现Gellert,Lehman,Richardson和Hurwitz Laboratories。自发现以来,DNA连接酶已成为分子生物学的重要工具。DNA连接酶用于分子克隆以将DNA片段连接在一起以产生重组DNA,例如当将一块外来DNA插入质粒中时。

大多数连接反应涉及已经从限制性消化产生的DNA片段,其中粘性或钝端。虽然某些协议描述了,但是在限制性消化后通常进行连接。虽然某些协议描述了一个一种管PCR克隆方法在相同反应中允许限制性消化和结扎均匀发生。

T4 DNA Ligase:你需要的唯一的Ligase?

T4 DNA连接酶是分子生物学中最广泛使用的连接酶。与其亲属,t3和t7连接酶一样,它以首次鉴定的噬菌体命名。它是ATP依赖性DNA连接酶,因为它在5'-PO的共价联系期间水解ATP4.和3'-OH群体。

建议使用这种多功能的连接酶进行大多数例程分子克隆应用因为它可以使钝性和粘性结束的双链DNA片段(通常在质粒载体和插入物之间)以及T / A克隆。

由于T4 DNA连接酶的多功能性,即结合粘性和钝结端,它已经针对一系列快速和有效连接的条件进行了优化。T4 DNA连接酶的一些变体已被设计为承受高盐和高温高达50°C。这种DNA连接酶可用于用高盐浓度或升高的温度连接结扎反应。在较高温度下进行结扎减少孵育时间并增加结扎的特异性。T4 DNA连接酶也已用于快速结扎,其中反应在室温下在5分钟内发生,而不是在16℃下过夜,使用特殊优化的缓冲区这提高了结扎效率。如果你匆忙选择一个快速的DNA连接酶!

那么,是T4 DNA连接酶唯一需要的Ligase吗?嗯,虽然它确实在实验室中执行DNA连接酶的许多标准应用,但它确实有一些缺点。

它不是特别耐盐

The activity of T4 DNA ligases begins to decline rapidly when salt concentrations exceed 200 mM, so if the conditions for your ligation involve high levels of salt (e.g. when salt carryover is an issue from previous steps), you may experience issues and would be better choosing an alternative ligase.

幸运的是,其他选择可用。T3 DNA连接酶,这也可以将钝性和粘性的DNA片段连接,可耐受高达250-300mm的盐浓度。但是,这不是你唯一的选择。已经产生了可以承受高达500 mm的盐浓度的T4连接酶的变体,例如盐T4 DNA连接酶

它结扎了钝端以及粘性末端

虽然这最初可能似乎不是一个问题,但可能有时有时候在反应中有凝聚力和钝的DNA,并且您只想加上粘性末端。在这种情况下,T7 DNA连接酶是您的朋友,因为它不会钝端。

大肠杆菌DNA Ligase是这种情况的另一个选择。该连接酶不会使钝端的钝端并具有比T4连接酶的粘合末端更高的亲和力。大肠杆菌DNA连接酶是NAD +依赖性连接酶,因此您使用的缓冲液将与T4连接酶不同。

它可以在缺口中加相不匹配

T4 DNA连接酶是一个非常活跃的连接酶,而在一般的DNA连接酶中较喜欢完全Watson-Crick碱基配对DNA,T4连接酶可以在DNA缺口中加相失配。如果高保真性解除切割的DNA是您的目标,那么NAD +依赖Taq.DNA Ligase是该工作的工具。

恒温Taq.DNA连接酶在较高温度下也活跃(37-75O.C)。在高温下进行连接的能力和更高的保真度Taq.DNA连接酶降低了错配重组DNA的发生率。但请注意,这种酶只能在缺口而不是钝或内聚的末端。

尼克斯的选择性结扎Taq.DNA Ligase使其成为一种完美的解决方案,即仅需要抑制刻痕并抑制结束连接,例如一些DNA组装方法。有许多应用程序利用Taq DNA连接酶的高保真凝固,包括单核苷酸多态性的检测和定量。

Ligase应用程序概述

虽然T4 DNA连接酶可以是许多分子生物学应用的选择的连接,但它并不总是为工作的最佳连接酶。为了快速概述不同的连接功能的功能,请参阅下面的快速查找表。

应用 T4. T3. T7. 大肠杆菌 Taq.
凝聚力结束结扎 ✔✔ ✔✔
仅结扎粘性末端 ✔✔
钝结结扎 ✔✔ ✔✔
t / a克隆 ✔✔
快速结扎 ✔✔*
高温结扎 ✔** ✔✔
高盐条件结扎 ✔✔*** ✔✔
高保真的缺点 ✔✔
*快速连接酶;**高温耐受品种;***高耐盐品种

保持上述要点,为您的下一次连接应用选择DNA连接酶不应该是不难的!你使用t4以外的连接酶吗?留下以下评论。

进一步阅读

DNA连接酶,T4在沃辛顿酶手册中。沃辛顿生物化学公司。(2019)。

舒曼,S.DNA Ligases:进步和前景。JBC。284(26); 17365-9(2009)。DOI 10.1074 / JBC.R900017200

基于基于基质的连接酶选择图。新英格兰Biolabs。

DNA连接酶选择图表。新英格兰Biolabs。

Lehnman,I.R ..DNA连接酶:结构,机制和功能。科学,186(4166); 790-797(1974)。DOI:10.1126 / Science.186.4166.790

DNA连接酶中的底物特异性和错配鉴别。新英格兰Biolabs.

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