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miRNA表达:如何选择正确的分析平台

多个地铁平台代表可用于miRNA分析的多个平台

mirna高度保守小非编码rna对健康和患病状态的一系列过程负面调节一系列过程,并且对于各种条件的生物标志物也是有价值的。这就是为什么MiRNA分析目前是巨大的生物学兴趣和快速增长的研究领域。但是,在您开始破译之前miRNA的兴趣调节生物反应,您需要一个敏感,可重复和广泛接受的MiRNA分析平台来衡量表达。在本文中,我们将讨论选择MiRNA分析的平台和可用的不同选项时需要考虑的事情。

选择miRNA分析平台时的考虑

有各种各样的miRNA分析平台可供选择,在设计你的实验时需要考虑很多因素,从成本到准确性。因此,为你的miRNA表达实验选择一个分析平台是令人畏惧的。以下是你在选择miRNA分析平台时需要考虑的一些事情:

  1. 目标:您的目标是获得miRNA repertoire的准确整体图片,理解miRNA成熟的过程,还是深入研究一组选择miRNA的生物学意义?
  2. 动态范围你想检测2-或2×106.-你感兴趣的miRNA的倍数变化?
  3. 特异性成熟的miRNA在19和25个核苷酸之间变化,从更长的前体通过MultiSep生物生物发生而产生。这产生了一种具有略有差异的异源池,可能会调节不同的目标。您是否知道您打算概况的miRNA生物生成过程的阶段?您是否知道您的平台是否能够区分不成熟和成熟的miRNA或具有非常相似序列的miRNA?
  4. 分析:您是否有预算/可用性进行广泛的生物信息分析。是对参考基因表达的归一化,这相对较快,但可以诱导偏见,可接受?
  5. 一次投资在几小时内需要成果,还是可以给实验给几周?你有时间学习复杂的分析吗?

我的选择是什么?

现在我们来谈谈可以用于miRNA分析的平台。每个平台都有自己的优缺点,你的选择最终取决于成本、时间、技能、灵敏度、准确性,当然还有再现性:

1.定量实时PCR

实时定量PCR (Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)是任何基因表达实验的金标准,也可用于mirna成熟的任何阶段的检测。在该实验中,使用特异性引物扩增细胞总RNA的异质混合物中的miRNAs。

优点

  • 总RNA很方便地用作输入,所以不需要预估大小。
  • 这是太快了。
  • 它被广泛认为是高度可复制的。

缺点

  • QRT-PCR.在放大期间使用各个miRNA的引物,这意味着您需要知道您要查找的具体miRNA。
  • 在你的实验设计中可能存在有利于预先测序的mirna的选择偏差。
  • 高通量分析是具有挑战性的,因为在相同的PCR反应条件下分析几个miRNA是不可行的,因为它们固有地折叠自身以形成发夹结构。

2.杂交的玻璃滑动微阵列

这种技术在过去几十年中得到了很好的优化,并为miRNA分析提供了一种强大的选择。这里,来自组织或细胞样品的总标记的RNA与所有兴趣中所有成熟miRNA的标准玻璃滑动阵列杂交。然后使用原始数据来计算复杂的热手段,以便在不同的样本之间进行比较。

优点

  • 由于MiRNA是小于典型的转录物,因此甚至在微阵列滑动上的短寡头探针甚至用精确度杂交到目标,降低了微阵列产生的成本。较短的miRNA探针还提高了敏感性和检测特异性。
  • 由于发现了新的miRNA,自定义微阵列芯片在单个芯片上容纳整套已知的miRNA,允许在更广泛接受的平台上验证的快速可靠的高通量分析,如QPCR和Northern印迹。

缺点

  • 由于miRNAs比典型的转录本要小得多,可能只包含细胞或组织RNA样本中有限的一部分,如果需要精确测量成熟的pre-miRNAs,可能有必要通过预先大小选择来丰富你的样本的miRNAs。
  • 另一方面,由于临床样本的数量往往有限,提取的miRNA总量往往很小。非特异性扩增可用于增加miRNA样本,但当测量表达水平时,这意味着你将失去总输入样本与测量的miRNA数量之间的直接对应关系,从而在分析中引入非线性。

3.新一代测序

下一代测序(NGS)在生物和临床实验室中快速获得普及,并提供了一种研究miRNA表达谱的另一种方法。NGS涉及将适配器连接到样本RNA并通过PCR扩增产生cDNA文库。然后筛选文库的对应于miRNA的长度并与合适的参考序列对齐。

优点

  • 识别分析样本中的所有microRNA分子,不受新microRNA发现率和序列亚型的限制。
  • 它可以是高吞吐量。
  • 有可能实现自动化,可以最大限度地减少手动时间并减少手动采样误差。
  • 它可以同时测量表达水平和序列变化。

缺点

  • 它需要很多时间来执行。
  • 需要在工作流程结束时进行数据分析的技术人员。[1]
  • 在测量中由于放大而产生的非线性潜力。

4. Northern印迹杂交

传统的Northern blot检测异种混合物中的特定RNA分子。这种方法包括电泳分解细胞总RNA,将分解后的RNA印迹到膜上,然后杂交标记探针,以在x光胶片上看到感兴趣的RNA。对传统的Northern印迹方法进行了几项改进,使其能够提供足够高的分辨率来检测单个核苷酸的变化和非常短的rna。[2]

优点

  • 它为低丰度MiRNA提供了卓越的敏感性和特异性。
  • 它在检测表达水平的微小变化方面提供了卓越的灵敏度,这是微阵列所不能做到的。
  • 具有多种标签的所有miRNA种类容易获得预测的探针,该品种允许多路复用和分层化测定。
  • 由于样品在任何阶段未扩增,因此您可以在总RNA中检测miRNA,而不是在人工扩增的混合物中。
  • 由于电泳分辨率,除了其表达水平之外,Northern印迹还检测miRNA的大小。
  • 印迹膜可以储存,剥离和重新探测多年。

缺点

  • 非常耗时。
  • 需要大输入样本。
  • 它通常需要放射性标记,以提高总RNA中低丰度MIRNA的敏感性。
  • 它不容易适用于高通量分析,并用于评估一个或少量miRNA。

5. RNase保护测定

该测定背后的想法利用了rnase酶仅切断单链RNA的奇妙事实,留下双链式RNA。标记的总RNA样品与其miRNA补蛋白杂交杂交,与RNase孵育以切掉未杂交的单链RNA,在聚丙烯酰胺凝胶上分解并呈上膜上以检测与探针结合的相应标记的miRNA的信号强度。[3]

优点

  • 为低丰度miRNAs提供优越的敏感性和特异性。
  • 具有多种标签的所有miRNA种类容易获得预测的探针,该品种允许多路复用和分层化测定。
  • 因为样本在任何阶段都没有扩增,所以你在总RNA池中检测感兴趣的mirna,而不是在人工扩增的混合物中。

缺点

  • 非常耗时。
  • 需要大输入样本。
  • 它通常需要放射性标记,以提高总RNA中低丰度MIRNA的敏感性。对于高通量分析,它不容易允许。
  • 必须知道要检测的miRNA的序列。

尽管Northern印迹和RNase保护测定的局限性,但它们通常用作辅助方案以确认通过其他方法获得的结果。

6.基于纳米技术的MiRNA分析平台

这些是最近的创新,仍然主要在研发阶段。这些方法使用设计的纳米孔 - 分子尺度孔 - 以及它们的电导特性,以检测纳米孔内选择性单一MiRNA分子的位置和构象。

优点

  • 提供敏感,特异性,定量和无偏倚的miRNA计数,长度和构象数据。
  • 它不需要诸如标记,结扎,逆转录或扩增的酶促步骤。[4]

缺点

  • 目前没有商业上可用。

MiRNA Profiling平台总结了

平台 时间 输入 成本 笔记
存在/微流体 < 6小时 500 / 10ng. < 400美元 高通量、自动分析已知miRNAs;验证性试验;对内参基因表达进行归一化分析
微阵列 〜2天 100ng-1μg. ~ 300美元 高通量;概要文件的microrna;对内参基因表达进行归一化分析
ngs. 1-2周 500年ng-5µg > 1000美元 概况所有miRNA;高吞吐量;相当大的生物信息分析
Northern blot/RNase保护试验 > 1周 20-60μg. 800美元 高样本输入;概要文件的microrna;耗时;费力
纳米孔方法 <3小时 ~ 1µg 实验 目前不可商业;承诺敏感,特异性和无偏见的miRNA分析。

表1:miRNA分析平台的比较

要总结一下,如果您是传统的Stickler,并且在使用手工制作试剂使用手工协议时,您可以押注您的生活,您可能选择传统平台并进行RNASE保护测定或北方印迹以测量miRNA样品中的表达水平。如果不是这种情况,您可以选择研究文献中的当前金标准,并进行定量实时PCR。如果您担心更传统的方法中的偏见并在手中有时间和资金,您可以投资于优化基于纳米技术的测定。

说到做到,在成本,方便性,精密度,准确度和样品可用性之间取得最佳平衡优化理想的方法,您需要非常小心地考虑每个分析平台的优缺点。

引用:

  1. kolanowska m,.(2018)使用下一代测序的MicroRNA分析方法杂志.1823:87-101。DOI:10.1007 / 978-1-4939-8624-8_8。
  2. Koscianska E,.(2011)MicroRNA的Northern印迹分析,其前体和RNA干扰触发器。BMC分子生物学.12:14。DOI: 10.1186 / 1471-2199-12-14
  3. yamamura s,.(2012)用荧光标记的核开孔使用微芯片电泳检测细胞培养物中的miRNA传感器(巴塞尔).12(6):7576-7586。DOI:10.3390 / S120607576
  4. 顾lq,.(2012)用纳米孔单分子计数器检测miRNAs专家Rev Mol Diagn.12(6):573-84。DOI:10.1586 / ERM.12.58。
多个地铁平台代表可用于miRNA分析的多个平台

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