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miRNA表达式:如何选择正确的分析平台

多个地铁平台代表可用于miRNA分析的多个平台

mirnas高度保守小非编码RNA对健康和患病状态的一系列过程负面调节一系列过程,并且对于各种条件的生物标志物也是有价值的。这就是为什么MiRNA分析目前是巨大的生物学兴趣和快速增长的研究领域。但是,在您开始破译之前miRNA的兴趣调节生物反应,您需要一个敏感,可重复和广泛接受的MiRNA分析平台来衡量表达。在本文中,我们将讨论选择MiRNA分析的平台和可用的不同选项时需要考虑的事情。

选择miRNA分析平台时的考虑因素

在设计实验时,有各种各样的MiRNA分析平台,以及许多因素考虑,从成本到准确性。因此,它可以令人生畏为miRNA表达实验选择分析平台。以下是在选择MiRNA Profiling平台时需要考虑的事情的简要讨论:

  1. 目标:您的目标是获得miRNA曲目的准确整体图景,了解miRNA成熟的过程,或深入研究选择的miRNA的生物学意义吗?
  2. 动态范围你想检测2-或2×106.- 感兴趣的miRNA中的更换吗?
  3. 特异性成熟的miRNA在19和25个核苷酸之间变化,从更长的前体通过MultiSep生物生物发生而产生。这产生了一种具有略有差异的异源池,可能会调节不同的目标。您是否知道您打算概况的miRNA生物生成过程的阶段?您是否知道您的平台是否能够区分不成熟和成熟的miRNA或具有非常相似序列的miRNA?
  4. 分析:您是否有预算/可用性进行广泛的生物信息分析。是对参考基因表达的归一化,这相对较快,但可以诱导偏见,可接受?
  5. 时间投资在几小时内需要成果,还是可以给实验给几周?你有时间学习复杂的分析吗?

我的选择是什么?

现在让我们来谈谈你可以用于miRNA分析的平台。每个平台都有自己的利弊,您的选择将最终取决于您的成本,时间,技能,敏感性,准确性以及当然的优先事项,可重复性:

1.定量实时PCR

定量实时PCR(QRT-PCR)是任何基因表达实验中的金标准,也可用于在任何成熟阶段检测miRNA。在该测定中,使用特异性引物扩增总细胞RNA的异细胞混合物中的miRNA。

凡好

  • 总RNA方便地用作输入,因此不需要预尺寸。
  • 它很快。
  • 它被广泛被接受为高度可重复性。

cons

  • QRT-PCR.在放大期间使用各个miRNA的引物,这意味着您需要知道您要查找的具体miRNA。
  • 您的实验设计中的选择偏差有利于预先测序的miRNA。
  • 高通量分析是具有挑战性的,因为在相同的PCR反应条件下分析几个miRNA是不可行的,因为它们固有地折叠自身以形成发夹结构。

2.杂交的玻璃滑动微阵列

这种技术在过去几十年中得到了很好的优化,并为miRNA分析提供了一种强大的选择。这里,来自组织或细胞样品的总标记的RNA与所有兴趣中所有成熟miRNA的标准玻璃滑动阵列杂交。然后使用原始数据来计算复杂的热手段,以便在不同的样本之间进行比较。

凡好

  • 由于MiRNA是小于典型的转录物,因此甚至在微阵列滑动上的短寡头探针甚至用精确度杂交到目标,降低了微阵列产生的成本。较短的miRNA探针还提高了敏感性和检测特异性。
  • 由于发现了新的miRNA,自定义微阵列芯片在单个芯片上容纳整套已知的miRNA,允许在更广泛接受的平台上验证的快速可靠的高通量分析,如QPCR和Northern印迹。

cons

  • 由于MiRNA比典型的转录物小,并且可以仅包括总细胞或组织RNA样品的有限部分,因此如果预定选择的预先测量的预先测量,则可能需要通过先前尺寸选择来富集您的样品。需要。
  • 在侧面,由于临床样品通常限制,因此提取的miRNA的总量通常很小。可以使用非特异性扩增来增加miRNA样品,但是在测量表达水平时,这意味着您将在总输入样品和测量的miRNA之间失去直接对应,在测定中引入非线性。

3.下一代测序

下一代测序(NGS)在生物和临床实验室中快速获得普及,并提供了一种研究miRNA表达谱的另一种方法。NGS涉及将适配器连接到样本RNA并通过PCR扩增产生cDNA文库。然后筛选文库的对应于miRNA的长度并与合适的参考序列对齐。

凡好

  • 识别分析的样品中的所有microRNA分子,并且不受新型微稻草和序列同种型的发现率的限制。
  • 它可以是高吞吐量。
  • 有可能实现自动化,可以最大限度地减少手动时间并减少手动采样误差。
  • 它可以同时测量表达水平和序列变化。

cons

  • 它需要很多时间来表演。
  • 需要在工作流程结束时进行数据分析的技术人员。[1]
  • 由于扩增导致的测量中的非线性潜力。

4. Northern印迹杂交

传统的Northern印迹检测异质混合物中的特异性RNA分子。该方法涉及电泳解析总细胞RNA,将分离的RNA印刷到膜上并杂交标记的探针,以使您在X射线膜上可视化您的RNA对兴趣的探针。已经对传统的Northern印迹方案进行了几种改进,以提供足够高的分辨率以检测单核苷酸变化和非常短的RNA。[2]

凡好

  • 它为低丰度MiRNA提供了卓越的敏感性和特异性。
  • 它在检测微阵列不能的表达水平的小变化方面提供了卓越的敏感性。
  • 具有多种标签的所有miRNA种类容易获得预测的探针,该品种允许多路复用和分层化测定。
  • 由于样品在任何阶段未扩增,因此您可以在总RNA中检测miRNA,而不是在人工扩增的混合物中。
  • 由于电泳分辨率,除了其表达水平之外,Northern印迹还检测miRNA的大小。
  • 可以储存,剥离和重新探测涂膜膜多年。

cons

  • 强烈耗时。
  • 需要大输入样本。
  • 它通常需要放射性标记,以提高总RNA中低丰度MIRNA的敏感性。
  • 它不容易适用于高通量分析,并用于评估一个或少量miRNA。

5. RNase保护测定

该测定背后的想法利用了rnase酶仅切断单链RNA的奇妙事实,留下双链式RNA。标记的总RNA样品与其miRNA补蛋白杂交杂交,与RNase孵育以切掉未杂交的单链RNA,在聚丙烯酰胺凝胶上分解并呈上膜上以检测与探针结合的相应标记的miRNA的信号强度。[3]

凡好

  • 为低丰度MiRNA提供卓越的敏感性和特异性。
  • 具有多种标签的所有miRNA种类容易获得预测的探针,该品种允许多路复用和分层化测定。
  • 由于样品在任何阶段未扩增,因此您在总RNA池中检测您的MIRNAS-兴趣,而不是在人工扩增的混合物中。

cons

  • 强烈耗时。
  • 需要大输入样本。
  • 它通常需要放射性标记,以提高总RNA中低丰度MIRNA的敏感性。对于高通量分析,它不容易允许。
  • 必须知道要检测的miRNA的序列。

尽管Northern印迹和RNase保护测定的局限性,但它们通常用作辅助方案以确认通过其他方法获得的结果。

6.基于纳米技术的MiRNA分析平台

这些是最近的创新,仍然主要在研发阶段。这些方法使用设计的纳米孔 - 分子尺度孔 - 以及它们的电导特性,以检测纳米孔内选择性单一MiRNA分子的位置和构象。

凡好

  • 提供关于miRNA计数,长度和构象的敏感,具体,定量和无偏的数据。
  • 它不需要诸如标记,结扎,逆转录或扩增的酶促步骤。[4]

cons

  • 目前没有商业上可用。

MiRNA Profiling平台总结了

平台 时间 输入 成本 笔记
QRT-PCR / Microfluidics <6小时 500 / 10ng <$ 400. 高吞吐量,已知的miRNA自动分析;确认测定;通过归一化以参考基因表达分析
微阵列 〜2天 100ng-1μg. 〜$ 300 高吞吐量;型材已知mirnas;通过归一化以参考基因表达分析
ngs. 1-2周 500ng-5μg. > 1000美元 概况所有miRNA;高吞吐量;相当大的生物信息分析
Northern印迹/ RNase保护测定 > 1周 20-60μg. 800美元 高样品输入;型材已知mirnas;耗时的;费力
纳米孔方法 <3小时 〜1μg. 实验 目前不可商业;承诺敏感,特异性和无偏见的miRNA分析。

表1:miRNA分析平台的比较

要总结一下,如果您是传统的Stickler,并且在使用手工制作试剂使用手工协议时,您可以押注您的生活,您可能选择传统平台并进行RNASE保护测定或北方印迹以测量miRNA样品中的表达水平。如果不是这种情况,您可以选择研究文献中的当前金标准,并进行定量实时PCR。如果您担心更传统的方法中的偏见并在手中有时间和资金,您可以投资于优化基于纳米技术的测定。

均说服,攻击成本,权宜之计,精度,准确性和样品可用性的最佳平衡,优化理想的方法,您需要考虑每个分析平台的优缺点,并以最大的关注。

参考:

  1. kolanowska m,。(2018)使用下一代测序的MicroRNA分析方法Mol Biol.。1823:87-101。DOI:10.1007 / 978-1-4939-8624-8_8。
  2. Koscianska E,。(2011)MicroRNA的Northern印迹分析,其前体和RNA干扰触发器。BMC分子生物学。12:14。DOI:10.1186 / 1471-2199-12-14
  3. yamamura s,。(2012)用荧光标记的核开孔使用微芯片电泳检测细胞培养物中的miRNA传感器(巴塞尔)。12(6):7576-7586。DOI:10.3390 / S120607576
  4. 顾lq,。(2012)用纳米孔单分子计数器检测miRNA专家Rev Mol Diagn。12(6):573-84。DOI:10.1586 / ERM.12.58。
多个地铁平台代表可用于miRNA分析的多个平台

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