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从拟南芥种子(和其他艰难的种子)中分离核酸

从拟南芥种子(和其他艰难的种子)中分离核酸

与任何样品一样,在分离核酸时,源物质的状态决定了破坏的方法。使用化学物质或超声波可以很容易地分解大多数生物材料,因此将核酸从细胞中取出是没有问题的。一般核酸分离试剂盒依赖于对起始物质的最大裂解;如果没有这一关键步骤,在隔离结束时就不会有核酸。但是你会用什么方法来处理像拟南芥种子这样的种子很小,种皮很硬的物质呢?或者是包裹在甲壳素中的酵母或昆虫?

这里面真冷

液氮是破坏大多数硬质物质的答案。在液氮中冷冻使材料变脆并且容易破裂。在冷冻时,可以使用砂浆和杵(总是戴手套和安全眼镜)磨练。使用石英砂和研磨助手将提高产量。更大种子体积的“高科技”解决方案将使用咖啡研磨机而不是砂浆和杵。

请记住:如果您的起始材料接地不佳,则没有套件将为您提供良好的结果。另一个令人失望的结果来源是不正确的储存材料。在提取核酸之前,请勿让磨粒粉末除霜。将其冷冻在70℃或立即使用。

RNA提取

拟南芥种子核酸提取的下一步重新悬浮了种子粉末。如果您使用RNA,可以防止材料氧化是必不可少的,因为RNA比DNA更稳定(其实,它是臭名昭着的容易退化),氧化是第一步进行RNA降解。加入萃取缓冲液的α-汞乙醇或其他抗氧化剂。重悬的粉末用作手动或试剂盒RNA提取的原料。

然而,在不完全的种子研磨或RNA降解之间,RNA提取的问题通常在种子中与萃取缓冲液中的其他化合物的干扰复合。从本质上讲,种子是需要的储存容器:(1)免受核酸酶被吃掉;(2)包含开展新兴拍摄所需的所有能源。因此,取决于植物物种,种子可分别含有酚类化合物并含有丰富的碳水化合物。这两种存活特征使RNA难以置信地困难。

例如,如果使用胍异硫氰酸胍(GITC)的RNA提取缓冲液如TRIZOL和RNEASY试剂盒,则来自拟南芥种子的淀粉​​导致样品凝固。淀粉也可以干扰RNA重新悬浮。因此,手册LiCl-苯酚方法更适合富含淀粉的种子(1)。LiCl-苯酚选择性地沉淀RNA,留下DNA,蛋白质和碳水化合物。根据感兴趣的RNA的大小,您可以改变LiCL浓度和离心时间。只要知道该方法可能不适合恢复50个核苷酸的最小RNA。这可能是纯化RNA探针的优势,但如果您对miRNA感兴趣,请切换到乙醇降水(2)。

如果你的种子含有高水平的酚化合物(即棉籽),请使用热硼酸盐法(2)。与缓冲液是酸性的LiCl-苯酚方法不同,热硼酸盐法的萃取缓冲液是碱性的。缓冲液补充有PVP-40,脱氧胆酸盐和/或NP-40,为切子剂(3)。

总而言之,如果您遇到从种子中提取核酸的问题,首先尝试通过确保完整的种子崩解和彻底的重悬浮来改善提取物的质量。如果这没有帮助,请切换到手动提取。套件是节省时间的快捷方式,但如果他们不起作用,没有什么能击败一点肘部油脂。

来源:

  1. 从淀粉含量高的种子胚乳中快速提取高质量RNA的方法。李Z.和技巧H.N. Biotechniques(2018)38:872-876
  2. 改进的热硼酸盐法显著提高了棉花优质RNA的产量gossypium hirsutum l)。Wan陈守惠、WilkinsT.A。分析生物化学(1994) 223(1):第7-12页
图像信用:Rawpixel.com.

1条评论

  1. Iswarya. 4月4日,2020年下午3:21

    RNA提取的有趣方法

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