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贤哲科学为生命科学研究开发了样品预备技术。我们专注于改善和自动化下一个Gen测序工作流程的高价值步骤的电泳方法。

Sage销售PIPPIN™系列DNA尺寸选择仪器,这些仪器广泛用于DNA,RNA和芯片-SEQ图书馆构建,用于短读测序。我们的系统还用于制备用于第3代,远程基因组学平台的高分子量DNA。

我们的产品是在美国马萨诸塞州的贝弗利的总部制造的。

如何将DNA与线粒体分离出来:一个能量指南

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手显示dna螺旋的孤立

为什么学习线粒体DNA?

线粒体产生大部分腺苷三磷酸(ATP),其需要为多种细胞过程提供动力。这些细胞发电机具有16 kB循环基因组,其编码少数蛋白质,[1]和线粒体DNA(MTDNA)的突变与广泛的疾病相关,包括听力损失,肌肉疾病,糖尿病,神经变性疾病和神经变性疾病癌症。[2,3]

在您可以序列MTDNA之前研究这些突变在这些和其他疾病中的效果之前,您首先需要孤立它。MTDNA以几种基本方式与核DNA不同。为了确保在隔离和排序MTDNA时,您的结果是可靠的,您需要理解并考虑这些差异。

MTDNA的特征

每种细胞数百份副本

大多数真核细胞含有数百个线粒体,其中数百份MTDNA(每种细胞估计为2-10,000 mtDNA拷贝)。[4]因此,对于只有线粒体的子集存在,常见的是存在。因此,并非所有这些线粒体基因组在细胞或生物体内都是相同的。这被称为异质。

高突变率

在大多数生物中,线粒体是母体遗传的,因为这种装载量的遗传重组是有限的。线粒体基因组的其他变异原因包括缺乏综合的DNA修复机制[5]和组蛋白,以及高度氧化环境;所有这些都有助于增加突变率。这种异质性可以使鉴定疾病相关的突变更具攻击性,因为在观察到临床症状之前经常需要达到阈值水平的阈值水平。[6]用于分离MTDNA的技术需要保留这种异质性并允许定量。

微骨质上的

一种有机体的线粒体基因组可以容纳数百个独立突变,该突变在1-2%的所述线粒体基因组中发现。该微素质性进一步使MTDNA的分析复杂化,因为通过标准PCR技术不量化这些突变。

核线粒体伪原因的存在性

最后,从线粒体基因的整合到核基因组中,核线粒体(Numt)伪可能产生,通常在非编码区中。Numts的存在是鉴定线粒体遗传变异性的混淆因素。[7] MTDNA提取方法应有效去除核DNA以限制下游分析中NUM的干扰。

尽管副本数量高,但MTDNA仅贡献细胞总DNA含量的0.2%。这种少数群体状态以及观察到的MTDNA的异质性需要富集用于线粒体DNA的样品在测序之前,以最大化检测MTDNA中突变的能力。

如何丰富线粒体DNA

有各种方法可用于丰富MTDNA,但在选择一个之前,您应该考虑以下内容:

  • 您需要为下游分析所需的纯度和浓缩等级
  • 您可以在丰富过程中花费的时间
  • 执行该方法所需的技能和掌握程度。

用于分离线粒体DNA的密度梯度离心

如果您可以访问超速纤维,MTDNA富集的黄金标准是通过密度梯度离心。在该方法中,总DNA加载到氯化铯密度梯度上,并以450,000×g离心10小时,以便通过尺寸分离DNA。这种超离心的结果是两个不同的DNA带;较高的核DNA带和下线粒体DNA带。溴化乙锭增强了密度差异,允许更好地可视化DNA和艾滋病在收集中,这通过将针插入到适当的位置并除去富含线粒体DNA中的下带来实现。

虽然这是分离MTDNA的有效方法,但有几种缺点,包括:

  • 长超速离心步骤
  • 使用危险和有毒化学品
  • 耐心和灵巧收集MTDNA带。

而且,在超速离心步骤期间产生的力和使用皮下注射针从超速纤维管中提取DNA可能导致DNA剪切。

使用线粒体基因组特异性引物的PCR

可用于丰富MTDNA的另一种可用于MTDNA的低成本方法是使用MTDNA特异性引物进行PCR。通过使用仅使用仅一个或两个引物组的引物集合可以通过使用引物集合来扩增MTDNA的PCR富集以扩增片段中的MTDNA或通过远程PCR。[8,9]已经优化了手动方案,其结合了常规的MiniPREP试剂盒,基于沟通珠子的纯化和限制PCR扩增,以富合MTDNA。该方法具有额外的好处,即它不需要任何专用设备,只能访问PCR机器。

虽然PCR扩增确实提供了成本效益和有效的方法来丰富MTDNA,但该方法遭受一些限制。

  • 使用的聚合酶可以引入误差,使得难以区分线粒体基因组中的真正突变。
  • 如果您希望在扩增过程中丢失或改变,基于PCR的方法也是不合适的。

线粒体分离和酶促富集

另一种方法是在纯化MTDNA之前分离和分离整个线粒体细胞器。有几种可用的方法,包括差分离心,其使用几轮梯度离心来从细胞裂解物中分离完整的线粒体。或者,一些商业上可获得的套件使用TOM22的抗体,Mitochondria外膜蛋白易位孔的核心组分,与磁珠结合以分离线粒体。[10]

通过外切核酸酶消化富集MTDNA可以显着增加两种方法的成功。由于线粒体DNA是圆形的,并且核DNA是线性的,因此消化线性DNA的外切核酸酶提供进一步富集的MTDNA。[11]

在组合线粒体分离和外切核酸酶消化的同时是丰富MTDNA的成功方法,但这种方法具有以下限制:

  • 这是一个耗时的多学分方法
  • 使用多轮离心,这可能会损伤MTDNA并导致核DNA污染(如果通过差动离心分离线粒体)
  • 要求磁铁形式的专家设备捕获与珠子结合的线粒体(如果使用磁珠捕获线粒体)。

一种更简单的方法来丰富线粒体DNA

Sagehls™系统来自Sage Science提供更直接和自动化的方法,用于丰富MTDNA。在该系统中,将1-150万整个细胞加载到旁边的裂解缓冲液的专有琼脂糖凝胶盒上,通过电泳将其转移到样品中。一旦发生细胞裂解,细胞内容物就通过电泳通过琼脂糖。细胞材料,包括蛋白质,RNA和脂质,通过琼脂糖快速移动。核DNA大多数是染色体长度的核DNA在样品中保留在样品中,而较小的MTDNA迁移到凝胶中,允许它们的分离。然后使用电洗脱来回收用于在下游应用中使用的MTDNA,例如在Illumina上测序®平台。[12]

如何将DNA与线粒体分离出来:一个能量指南


图1. Sagehls凝胶盒上的MTDNA提取过程的示意图

Sagehls为富普纳提供了显着的益处。

  • 简单的。不需要先后裂解细胞。
  • 快的。来自全细胞样品的MTDNA富集少于3小时。
  • 高效的。不需要离心步骤,核DNA长度保持染色体,最小化样品中的NUMT。
  • 自动化。将细胞加载到琼脂糖凝胶上后,提取和尺寸选择是完全自动化的,这意味着您可以走开并专注于其他任务。
  • 有效的。获得的纯度水平与密度梯度离心相当,已经观察到MTDNA的20倍富集。[12]
  • 温和的。DNA不受冗长或重复的离心步骤,意思是DNA剪切最小化。
  • 结果。孤立的MTDNA可直接用于在Illumina平台上进行排序。

只要将样品分散到在加载到琼脂糖凝胶前将样品分散到单个细胞中,可以将MTDNA分离出多种样品,包括组织和悬浮液细胞培养物。

MTDNA提取总结

在测序之前对MTDNA进行富集是有益的,以最小化NUMT的存在,这可能对您的研究的分析和结果产生负面影响。这种富集是可以通过利用核和MTDNA之间的差异的多种方法来实现的,包括尺寸,细胞位置以及是否是线性或圆形的。Sagehls方法提供纯度和富集,可与密度梯度离心的金标准,以简单,快速,自动化的方式,无需超速离心。

参考

  1. 安德森·斯坦尔班卓·巴格尔(Barrell B),人体线粒体基因组的序列和组织自然。(1981)9.(290):457-65。DOI:10.1038 / 290457A0
  2. Ryzhkova Ai,Sazonova Ma,Sinyov VV,由MTDNA突变引起的线粒体疾病:迷你审查临床风险管理。(2018)14.:1933-42。DOI:10.2147 / TCRM.S154863
  3. 泰勒鲁沃特&turnbull dm。人类疾病中的线粒体DNA突变NAT Rev Genet.。(2005)6.(5):389-402。DOI:10.1038 / NRG1606
  4. 米勒FJ,Rosenfeldt FL,张C,基于PCR的测定,精确测定人骨骼和心肌中的线粒体DNA拷贝数:缺乏年龄的拷贝数核酸res.。(2003)31.(11):E61。DOI:10.1093 / NAR / GNG060
  5. Bogenhagen df。修复脊椎动物的MTDNA我是J HUM Genet。1999年64.(5):1276-81。DOI:10.1086 / 302392
  6. rossignol r;Faustin B;罗恩c,线粒体阈值效应。Biochem J.(2003)370.(3):751-62。DOI:10.1042 / BJ20021594
  7. Simone,D.,Calabrese,F.M.,Lang,M.在UCSC基因组浏览器上验证和实施的参考人体核线粒体序列序列编译BMC基因组学(2011)12.,517. DOI:10.1186 / 1471-2164-12-517
  8. 拉莫斯A,Santos C,Alvarez L,人体线粒体DNA完全扩增和测序:一种新的验证引物组,可防止线粒体源性的核DNA序列共扩增电泳。(2009)30.(9):1587-93。DOI:10.1002 / ELP.200800601。
  9. 崔h,李f,陈d,等等。整个线粒体基因组的综合下一代序列分析显示出对线粒体DNA疾病的分子诊断的新见解Genet Med.(2013)15,388-94。DOI:10.1038 / gim.2012.144
  10. 弗兰克a,aris或,bergschneider e,使用自动组织破坏和富集抗托木磁珠,从小鼠组织中有效地分离小鼠组织的纯和功能性线粒体普罗斯一体8.(12):E82392。DOI:10.1371 / journal.pone.0082392
  11. Gould MP,Bosworth Cm,McMahon S,来自人血液和细胞系的线粒体DNA的无线富集用于高质量的下一代DNA测序普罗斯一体(2015)10.(10):E0139253。DOI:10.1371 / journal.pone.0139253
  12. Boles C&Houde N.使用Sagehls系统靶向线粒体DNA提取和富集。应用笔记:Sagehls。Sage Science Ltd. 2019。
手显示dna螺旋的孤立

3评论

  1. Dr.Ahmed. 4月1日,2020年晚上8:43

    嗨劳拉博士非常感谢

  2. Mehdi. 4月1日,2020年4:42

    嗨亲爱的劳拉。非常感谢

  3. 布拉德朗霍尔特 4月1日,2020年下午4:36

    基于DNA甲基化的另一种选择:
    https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0076096
    (披露:我在这种方法上工作)

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