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CRISPR基因编辑:注意事项和入门

内容赞助Sigma-Aldrich®高级基因组学

Crispr-cas复合物的图象靶向dna与grna

CRISPR(聚类,定期间隙,短的回文重复)-CAS系统在微生物中演变为防御侵入噬菌体的防御机制。如今,它为生物技术中最令人兴奋和最快的发展工具组成的基础,使我们能够在任何细胞生物或组织中编辑任何基因。CRISPR-CAS承诺,从健康和诊断到农业和能源的所有内容都能实现前所未有的进展。

如果您正在探索如何利用这种技术在您的研究中,这篇文章将帮助您了解基础知识以获得启动。本文是第一个系列旨在携带您的系列克里普尔克旅行,请查看我们的其他文章

了解CRISPR基因编辑

CRISPR基因编辑过程由由细菌衍生的核酸酶(例如CAS9)和引导RNA(GRNA)组成的复合物驱动。GRNA是设计用于识别并将CAS核酸酶识别和引导至靶DNA区域的特异性RNA序列。GRNA由两部分组成:CRISPRRNA(CRRNA)和反式激活CRRNA(TRACRRNA)。

  1. CRRNA是对靶DNA互补的17-20个核苷酸序列,因此根据您的靶基因而变化。
  2. TracrRNA是一种不变的序列,用作将CAS核酸酶附着到rRNA的支架。

原始CRISPR编辑系统由由CRRNA和TracrRNA组成的两部分GRNA复合物驱动。最近,在一个RNA和TracrRNA组合成一个RNA分子中的单个GRNA(SGRNA)方法,由于其增加的易用性和使用简单,因此变得很受欢迎。CRISPR基因编辑系统的一般示意图可以在图1中看到。

显示不同类型合成GRNA的CRISPR基因编辑系统的示意图

图1. CRISPR基因编辑系统的示意图,显示用于CRISPR的不同类型的合成GRNA。信用:sigmaaldrich.com/crispr.

虽然核酸酶的靶向由GRNA引导,但是在靶位部位的下游也必须存在相邻的基序(PAM)的原始晶圆(PAM)。识别PAM允许核酸酶切割DNA,产生双链断裂(DSB)。最常用的核酸酶,Cas9得出链球菌Pyogenes,识别5'-ngg-3'的PAM序列(其中'n'是任何核苷酸)。然而,所需的特定PAM根据所用的核酸酶而变化,核酸酶从需要不同斑斑的不同物种中分离。[1]

一旦生成DSB,本机蜂窝DNA修复机械试图通过非同源终端连接(NHEJ)或同源导向的修复(HDR)来修复切割。

NHEJ是用于修复DSB的本机蜂窝机制。然而,因为NHEJ将DNA结合在一起在没有使用同源DNA模板的情况下,这是非常出错的。当这些误差导致核苷酸的插入或缺失(吲哚)时,通常发生帧突变突变,​​导致发生过早止码子的产生和功能丧失(LOF)突变。利用NHEJ的这种方法是QuSPR用于破坏(敲除)基因的主要方法。

相反,HDR是用于指导特定遗传序列(敲入)的替代和表达的机制。虽然使用了相同的基本CRISPR组分,但HDR利用含有侧翼的新所需序列的DNA供体模板。当介绍该供体模板以及CRISPR组分时,细胞将使用该模板通过同源重组来修复切割的DNA。结果是将新序列掺入靶基因。

CRISPR基因编辑入门

典型的CRISPR基因编辑工作流程可以分为以下关键步骤:

  1. GRNA设计。
  2. 将编辑复合物递送到您的细胞或胚​​胎中。
  3. 细胞选择
  4. 分析成功编辑的细胞。
CRISPR设计,交付和分析步骤。

图2. CRISPR工作流程的关键步骤。

指导RNA(GRNA)设计

对GRNA的仔细设计对于您的CRISPR实验的成功至关重要。设计不良的GRNA可能未能产生有效的敲除,或者它可能通过结合基因组DNA的其他区域来导致不希望的偏离目标效果。以下是设计有效GRNA的几个提示:

  1. 确保存在PAM主题。如上所述,核酸酶需要PAM来切割它们的靶DNA。因此,必须在预期GRNA结合位点的下游存在特异于您的预期核酸酶的PAM。
  2. 获得GC内容权。据报道,GRNA的GC含量影响GRNA的活性。GC含量太低或高导致较低的切割效率。[2,3]因此建议您在可能的情况下使用GC含量为40-60%设计GRNA。[2]
  3. 考虑染色质无障碍。据报道,染色质可访问性是体内SGRNA结合的主要决定因素,在DNA的开放染色质区域中更频繁地发生成功结合。[4]
  4. 目标基本外显子。为了产生淘汰赛,重要的是设计GRNA以针对蛋白质功能至关重要的外显子,并且成功地产生了功能突变。
  5. 最大限度地减少偏离目标互补性。您的GRNA序列理想地应该是您的目标DNA独有的。然而,即使互补性不是100%,GRNA也可能绑定其他区域。有各种可用的计算工具可以帮助您确定GRNA是否具有其他潜在的绑定站点。

设计GRNA可能看起来很复杂,但在线资源如Sigma-Aldrich®CRISPR设计工具,使过程简单。

将CRISPR送入您的细胞

有多种方法可以提供CRISPR核酸酶(例如,Cas9)和GRNA进入细胞,包括瞬态转染(DNA,RNA或RNP),慢病毒转账,Piggybac融合,和核糖核蛋白(RNP)转染。区分这些方法的主要特征是它们是否瞬间或稳定地表达了CRISPR组件。

瞬态方法最适合单个基因敲除,因为它们与较少的离目标效果相关,而大规模筛选应用需要稳定的GRNA集成,以便在筛选过程结束时恢复和定量。

某些细胞类型,例如T细胞,难以用质粒载体转染,因为病毒载体引发免疫应答或质粒递送最终杀死靶细胞。在这种情况下,核糖核蛋白(RNP.)系统通常使用。这里,RNP,由纯化组成Cas9蛋白与GRNA复合,组装体外通过电穿孔或转染直接递送到靶细胞中。RNP提供更快的基因编辑,因为功能核酸酶立即可用。通过细胞蛋白酶迅速降解RNP复合物,使得编辑活性短寿命。可用RNP在细胞中的减少时间也降低了偏离目标效果。总的来说,RNP提供了一种有效和直接的方法,用于实现高水平的基因敲除,效率率达到70-80%。[5]

CRISPR选择标记

为了选择已成功转导的细胞,选择标记基因通常掺入表达CRISPR组分的载体中。

两个最常见的选择标记是:

  1. 通过荧光激活的细胞分选(FACS)允许富集转导细胞的荧光蛋白。
  2. 抗生素抗性基因,可使用适当的抗生素选择转导细胞。

选择标记不限于载体介导CRISPR交付方法。荧光团标记的Cas9 RNP复合物,如Mission™Cas9-GFP融合蛋白以及荧光团标记的GRNA可用。如上所述,使用RNP复合物的益处是它们从细胞中迅速移除。使用标记的RNP复合物使您可以实时观察核酸酶-GRNA复合物的这种间隙。

选择选择标记时的重要考虑因素是您所选择的细胞系包括任何预先存在的抗生素抗性或荧光标签,它们会干扰选择。

成功基因编辑的测量与分析

了解如何衡量您的CRISPR基因编辑实验的成功至关重要。有许多选择这样的选择,包括Sanger测序,不匹配检测测定,下一代测序(NGS),表型评估和靶向基因的mRNA和蛋白质水平。这些方法的灵敏度,可扩展性,分辨率和成本不同。[1]

例如,尽管NGS提供极高的灵敏度和分辨率,但它昂贵并且需要大量的技术专业知识来执行。另一方面,不匹配检测易于执行,但缺乏Sanger测序和NGS的敏感性。

确定indel的存在通常被认为是最佳实践。然而,只需测量对基因组的变化是不足以确定它们是否已破坏基因功能并产生引起表型反应的基因敲除。理想地使用验证良好的抗体来测量蛋白质水平也很重要。

其他考虑因素

目标细胞倍性和CRISPR编辑

您所选择的细胞系的倍率是使用CRISPR时的另一个重要考虑因素。这是重要信息,因为它决定了获得纯合突变体所需的突变数量。许多转化或癌细胞系具有更复杂的基因组构型(例如,三倍体),使它们更难以完成基因敲除的底物。相反,纯合突变体可以与相对容易的单倍体细胞获得。

CRISPR基因编辑的控制

选择正确的基因编辑实验的控制对于确定结果的有效性并在必要时促进故障排除至关重要。

许多不同类型的控制可以与CRISPR一起使用:

  • 阳性控制:已显示在系统中已成功针对另一个基因的GRNA可用于确认CRISPR在设置中正常工作。
  • 负面控制:不靶向GRNA或未靶向细胞基因组中任何基因的GRNA,可用于确认您的LOF表型不是技术伪影。

额外的控制可用于简化您的CRISPR基因编辑实验的解释。例如:

  • 生成多个空突变细胞系使用靶向相同基因的不同GRNA将大大降低您的LOF表型因偏离目标效果而导致的可能性。
  • 互补方法如Crispra.RNAi.可用于确认相同的表型。
  • 如果您的细胞允许,请考虑执行a救援实验其中,在其中瞬时或稳定地重新引入细胞系中的敲除基因以确认功能被恢复。基因的重新表达可以有效地实现ORF(开放阅读框)过表达为了确认观察到的表型是基因敲除的结果,而不是由于偏离目标效果。

CRISPR基因编辑综述

CRISPR-DRIVEN GENE编辑是当今最强大的工具之一。虽然所需的考虑数和设计选择可能似乎令人生畏,但是,您会发现适度的规划程度将在提高实验中取得成功的可能性,这将有很长的路要走。

本文仅介绍了对进行CRISPR实验的基本概念和考虑因素。我们鼓励您探讨下面列出的其他教育资源。

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参考

  1. Chatterjee,P.,极小相似的SPCAS9 Ortholog的PAM特异性科学推进,4,10(2018)。DOI:10.1126 / sciadv.aau0766
  2. 刘,X.与CRISPR / CAS9系统的切割效率相关的序列特征科学培训。6:19675(2016)。DOI:10.1038 / srep19675
  3. DOEAM,J.G。等等。高效SGRNA的理性设计CRISPR-CAS9介导的基因失活。NAT BIOTECHNOL.。32(12):1262-7。(2014)。DOI:10.1038 / NBT.3026
  4. 吴,X.CRISPR内切核酸酶CAS9在哺乳动物细胞中的基因组宽结合NAT BIOTECHNOL.。32(7):670-676。(2014)DOI:10.1038 / NBT.2889
  5. Kosicki,M.等等各种CRISPR / CAS9递送方法诱导的诱导诱导的动态PROG MOL BIOL晶片SCI152,49-67(2017)。DOI:10.1016 / BS.PMBTS.2017.09.0

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