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CRISPR基因编辑:注意事项和入门

内容由Sigma-Aldrich®高级基因组学

Crispr-cas复合物的图象靶向dna与grna

CRISPR(聚类,定期间隙,短的回文重复)-CAS系统在微生物中演变为防御侵入噬菌体的防御机制。如今,它为生物技术中最令人兴奋和最快的发展工具组成的基础,使我们能够在任何细胞生物或组织中编辑任何基因。CRISPR-CAS承诺,从健康和诊断到农业和能源的所有内容都能实现前所未有的进展。

如果您正在探索如何利用这种技术在您的研究中,这篇文章将帮助您了解基础知识以获得启动。本文是第一个系列旨在携带您的系列克里普尔克旅行,请查看我们的其他文章

理解CRISPR基因编辑

CRISPR基因编辑过程由由细菌衍生的核酸酶(例如CAS9)和引导RNA(GRNA)组成的复合物驱动。GRNA是设计用于识别并将CAS核酸酶识别和引导至靶DNA区域的特异性RNA序列。GRNA由两部分组成:CRISPRRNA(CRRNA)和反式激活CRRNA(TRACRRNA)。

  1. crRNA是与目标DNA互补的17-20个核苷酸序列,因此根据你的目标基因而不同。
  2. TracrRNA是一种不变的序列,用作将CAS核酸酶附着到rRNA的支架。

原始CRISPR编辑系统由由CRRNA和TracrRNA组成的两部分GRNA复合物驱动。最近,在一个RNA和TracrRNA组合成一个RNA分子中的单个GRNA(SGRNA)方法,由于其增加的易用性和使用简单,因此变得很受欢迎。CRISPR基因编辑系统的一般示意图可以在图1中看到。

显示不同类型合成GRNA的CRISPR基因编辑系统的示意图

图1所示。CRISPR基因编辑系统示意图,显示CRISPR合成的不同类型的gRNA。信贷:SigmaAldrich.com/CRISPR

虽然核酸酶的靶向由GRNA引导,但是在靶位部位的下游也必须存在相邻的基序(PAM)的原始晶圆(PAM)。识别PAM允许核酸酶切割DNA,产生双链断裂(DSB)。最常用的核酸酶,Cas9得出链球菌Pyogenes,识别PAM的5 ' -NGG-3 '序列(其中N '是任何核苷酸)。然而,所需要的特定PAM取决于所用的核酸酶,从不同种类分离出来的核酸酶需要不同的PAM。[1]

一旦dsb产生,原生细胞DNA修复机制试图通过非同源端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)来修复切口。

NHEJ是修复DSB的天然细胞机制。然而,由于NHEJ没有使用同源DNA模板将DNA末端连接在一起,它非常容易出错。当这些错误导致核苷酸的插入或删除(indels)时,经常发生移码突变,导致过早终止密码子的产生和功能丧失(LOF)突变。这种利用NHEJ的方法是CRISPR用来破坏(敲除)基因的主要手段。

相反,HDR是用于指导特定遗传序列(敲入)的替代和表达的机制。虽然使用了相同的基本CRISPR组分,但HDR利用含有侧翼的新所需序列的DNA供体模板。当介绍该供体模板以及CRISPR组分时,细胞将使用该模板通过同源重组来修复切割的DNA。结果是将新序列掺入靶基因。

CRISPR基因编辑入门

典型的CRISPR基因编辑工作流程可以分为以下关键步骤:

  1. GRNA设计。
  2. 将编辑复合物递送到您的细胞或胚​​胎中。
  3. 细胞选择
  4. 分析成功编辑的细胞。
CRISPR设计,交付和分析步骤。

图2。CRISPR工作流程的关键步骤。

指导RNA(GRNA)设计

仔细设计GRNA对您的成功至关重要CRISPR实验。设计不良的GRNA可能未能产生有效的敲除,或者它可能通过结合基因组DNA的其他区域来导致不希望的偏离目标效果。以下是设计有效GRNA的几个提示:

  1. 确保存在PAM主题。如上所述,核酸酶需要PAM来切割它们的靶DNA。因此,必须在预期GRNA结合位点的下游存在特异于您的预期核酸酶的PAM。
  2. 确定正确的gc含量。据报道,GRNA的GC含量影响GRNA的活性。GC含量太低或高导致较低的切割效率。[2,3]因此建议您在可能的情况下使用GC含量为40-60%设计GRNA。[2]
  3. 考虑染色质无障碍。据报道,染色质可访问性是体内SGRNA结合的主要决定因素,在DNA的开放染色质区域中更频繁地发生成功结合。[4]
  4. 外显子目标必不可少的。为了产生淘汰赛,重要的是设计GRNA以针对蛋白质功能至关重要的外显子,并且成功地产生了功能突变。
  5. 最大限度地减少偏离目标互补性。您的GRNA序列理想地应该是您的目标DNA独有的。然而,即使互补性不是100%,GRNA也可能绑定其他区域。有各种可用的计算工具可以帮助您确定GRNA是否具有其他潜在的绑定站点。

设计GRNA可能看起来很复杂,但在线资源如Sigma-Aldrich®CRISPR设计工具,简单地制作过程。

将CRISPR送入您的细胞

有多种方式可以交付CRISPR核酸酶(例如,Cas9)和GRNA进入细胞,包括瞬态转染(DNA, RNA,或RNP)慢病毒转账PiggyBac集成,以及核糖核蛋白(RNP)转染。区分这些方法的主要特征是它们是否瞬间或稳定地表达了CRISPR组件。

瞬态方法最适合单个基因敲除,因为它们与较少的离目标效果相关,而大规模筛选应用需要稳定的GRNA集成,以便在筛选过程结束时恢复和定量。

某些细胞类型,例如T细胞,难以用质粒载体转染,因为病毒载体引发免疫应答或质粒递送最终杀死靶细胞。在这种情况下,核糖核蛋白(RNP.)系统通常使用。这里,RNP,由纯化组成Cas9蛋白质与GRNA复合,组装在体外通过电穿孔或转染直接递送到靶细胞中。RNP提供更快的基因编辑,因为功能核酸酶立即可用。通过细胞蛋白酶迅速降解RNP复合物,使得编辑活性短寿命。可用RNP在细胞中的减少时间也降低了偏离目标效果。总的来说,RNP提供了一种有效和直接的方法,用于实现高水平的基因敲除,效率率达到70-80%。[5]

CRISPR选择标记

为了选择那些已经被成功转导的细胞,选择标记基因通常被整合到表达CRISPR成分的载体中。

两种最常见的选择标记是:

  1. 通过荧光激活细胞分选(FACS)使转导细胞富集的荧光蛋白。
  2. 抗生素抗性基因,可使用适当的抗生素选择转导细胞。

选择标记不限于载体介导CRISPR交付方法。荧光团标记的Cas9 RNP复合物,如MISSION™Cas9-GFP融合蛋白,以及荧光团标记的GRNA可用。如上所述,使用RNP复合物的益处是它们从细胞中迅速移除。使用标记的RNP复合物使您可以实时观察核酸酶-GRNA复合物的这种间隙。

选择选择标记时的重要考虑因素是您所选择的细胞系包括任何预先存在的抗生素抗性或荧光标签,它们会干扰选择。

成功基因编辑的测量与分析

知道你将如何衡量你的CRISPR基因编辑实验的成功是至关重要的。有很多方法可以做到这一点,包括Sanger测序、错配检测分析、下一代测序(NGS)、表型评估,以及测量你的目标基因的mRNA和蛋白质水平。这些方法在灵敏度、可扩展性、分辨率和成本方面有所不同。[1]

例如,虽然NGS提供了极高的灵敏度和分辨率,但它的成本很高,需要大量的技术专长来进行。失配检测容易进行,但缺乏Sanger测序和NGS的灵敏度。

确定indel是否存在通常被认为是最佳实践。然而,仅仅测量基因组的变化还不足以确定它们是否破坏了基因功能,并产生了导致表型反应的基因敲除。测量蛋白质水平也很重要,理想情况下使用一种验证良好的抗体。

额外的注意事项

目标细胞倍性和CRISPR编辑

在使用CRISPR时,你所选择的细胞系的倍性是另一个重要的考虑因素。这是非常重要的信息,因为它决定了获得纯合子LOF突变体所需的突变数。许多转化细胞系或癌细胞具有更复杂的基因组结构(例如,三倍体),使它们更难被完全基因敲除。相比之下,纯合突变体可以相对容易地从单倍体细胞中获得。

CRISPR基因编辑控件

选择正确的基因编辑实验的控制对于确定结果的有效性并在必要时促进故障排除至关重要。

许多不同类型的控制可以用于CRISPR:

  • 阳性控制:已显示在系统中已成功针对另一个基因的GRNA可用于确认CRISPR在设置中正常工作。
  • 负面控制:不靶向GRNA或未靶向细胞基因组中任何基因的GRNA,可用于确认您的LOF表型不是技术伪影。

额外的控制可以用来简化您的CRISPR基因编辑实验的解释。例如:

  • 生成多个空突变细胞系使用靶向相同基因的不同GRNA将大大降低您的LOF表型因偏离目标效果而导致的可能性。
  • 互补的方法,如Crispra.克里普利RNAi.可用于确认相同的表型。
  • 如果你的细胞允许,考虑做一个救援实验在这种情况下,你可以暂时或稳定地,在你的细胞系中重新引入敲除的基因,以确认功能恢复。基因的重新表达可以通过有效地实现ORF(开放阅读框)过表达为了确认观察到的表型是基因敲除的结果,而不是由于偏离目标效果。

CRISPR基因编辑综述

CRISPR-DRIVEN GENE编辑是当今最强大的工具之一。虽然所需的考虑数和设计选择可能似乎令人生畏,但是,您会发现适度的规划程度将在提高实验中取得成功的可能性,这将有很长的路要走。

本文的目的只是作为一个基本的概念和考虑进行CRISPR实验的介绍。我们鼓励您探索下面列出的其他教育资源。

更多CrisPr的资源

CRISPR文章

CRISPR网络研讨会

CRISPREBEB.

CRISPR基因编辑101

CRISPR工具

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参考

  1. Chatterjee, P。极小相似的SPCAS9 Ortholog的PAM特异性科学推进,4,10(2018)。DOI:10.1126 / sciadv.aau0766
  2. 刘,X.与CRISPR / CAS9系统的切割效率相关的序列特征Sci代表。6:19675(2016)。DOI:10.1038 / srep19675
  3. Doench, j·G。et al。高效SGRNA的理性设计CRISPR-CAS9介导的基因失活。NAT BIOTECHNOL.。32(12):1262-7。(2014)。DOI:10.1038 / NBT.3026
  4. 吴,X.CRISPR内切核酸酶CAS9在哺乳动物细胞中的基因组宽结合NAT BIOTECHNOL.。32(7):670-676。(2014)DOI:10.1038 / NBT.2889
  5. Kosicki,M.等一个各种CRISPR / CAS9递送方法诱导的诱导诱导的动态PROG MOL BIOL晶片SCI152年,49 - 67(2017)。DOI: 10.1016 / bs.pmbts.2017.09.0

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