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如何验证CRISPR实验

内容赞助Sigma-Aldrich®高级基因组学

测序数据的图像描绘验证Crispr

与任何研究实验一样,您验证您的重要性至关重要CRISPR驱动的基因编辑。至少,您需要确认:

  1. 将CRISPR试剂递送到您的细胞中。
  2. 成功和特异性编辑目标基因。
  3. 靶基因编码的蛋白质表达的预期变化。

本文介绍了最广泛用于验证CRISPR实验的一般方法和控制。

验证克里普尔试剂的交付

广泛地,有两种流行的方法用于验证成功递送CRISPR组件:1)荧光团体表达和2)抗生素抗性。每种方法都具有独特的特性,您可以选择同时使用它们。

通过荧光团表达验证CRISPR试剂递送

荧光团表达提供了一种简单但丰富多彩的方式,检查您的CRISPR试剂是否已成功送入您的细胞。如果使用质粒 - 或者,可以通过使用表达荧光蛋白(GFP)如绿色荧光蛋白(GFP)的载体来实现荧光团表达慢动力学为基础交付方法。对于RNP复杂递送,您可以使用标记为荧光团的指南RNA(RNA)或核酸酶。在这两种情况下,使用荧光激活的细胞分选(FACS)或显微镜通过细胞中的荧光团确认递送。

荧光团体表达还允许您通过将表达荧光团的细胞数与样品中的细胞的总数进行比较来计算递送方法的效率。如果使用FACS,则通过仅分离表达荧光团最高水平的细胞,可以进行样品富集。

Milliporeigma重组CAS9-GFP蛋白(RNP复合体)和几个不同的载体用于表达各种荧光团的质粒转染或慢病毒转染。这些CRISPR控制允许您确定CRISPR试剂的递送到您的细胞是否成功并通过荧光激活的细胞分选(FACS)实时从细胞中监测它们的间隙。[1]

通过抗生素选择验证CRISPR试剂递送

除了表达荧光团如GFP之外,一些载体含有抗生素抗性基因,如嘌呤霉素-N-乙酰转移酶(PAC)。通过抗生素选择标记,在抗生素存在下的细胞存活提供了质粒的递送和随后的编码核酸酶的表达。抗生素选择也使得可以仅分离并仅富含那些掺入CRISPR组分的细胞。

重要的是要注意,虽然荧光团体表达或抗生素选择只能确认成功的CrispRup试剂递送,但它们不确定所需的序列是否成功靶向。

验证成功的遗传目标

确认成功的基因靶向需要检测通过CRISPR实验引入的插入或缺失(Indels)。[2]在这里,我们描述了一些最常见的方法,但您的选择将取决于一系列因素,包括您希望制作的基因类型的类型和预算。

Sanger DNA测序

由于其可靠性,灵敏度及其精确识别引入的突变的能力,Sanger DNA测序仍然是验证的金标准。Sanger测序的主要缺点是该方法的耗时和劳动密集型性质;在测序之前,需要多种制备步骤来建立克隆细胞群。

下一代测序

下一代测序(NGS)具有绕过建立围绕突变的克隆细胞群的需要的明显优势。NGS可以在细胞群中识别均匀的罕见突变。虽然在动物和人类应用的情况下强制性,但NGS方法的每次运行的错误率和成本仍然很高。续集技术和下降成本的持续推进表明,NGS将很快成为CrispR预编辑的主导验证选择。

测量师核酸酶测定

测量仪™核酸酶测定是研究人员的可访问方法,基于不匹配检测原理。在该方法中,来自编辑等位基因的PCR产物池是变性和碎片化的,之后,测量仪核酸酶选择性地检测和切割由于indel在引入的其中一个股线上存在而被匹配的那些对。细胞NHEJ修复过程。在琼脂糖凝胶上检测到包含不匹配的切割的DNA扩增子。进一步证实,通过Sanger测序可以实现在切割位点在切割位点引入突变。

测量仪核酸酶测定是一种快速且价格合理的方法,但它有局限性。例如,测定将错过一些小型诱导,并且不能与自然发生的多态性区分Crispr衍生的indel。[4]

潮汐测定

在需要更敏感的indel检测方法的情况下,通过分解(潮汐)的诱导的跟踪可能更合适。潮汐是一种三步法,其中由核酸酶靶向的基因组区域从转染细胞分离的DNA扩增。通过软件分析PCR产物的Sanger序列,以确定是否存在基于与野生型序列的比较存在的诱导。该软件还识别精确的断裂网站,并估计每个indel的统计学意义。

潮汐降低了验证的总成本,因为它允许在混合细胞群上进行桑格序列。然而,这种汇集的方法意味着它无法区分两位相同的等位基因,并且它与罕见的等位基因斗争。此外,潮汐的可靠性取决于PCR产物和Sanger序列的质量。

验证成功的表达丧失

成功引入诱导突变进入您感兴趣的基因并不能保证对相应蛋白质的表达中断。因此,重要的是确认由靶基因编码的蛋白质不再在编辑细胞中表达。

检查蛋白质表达的最简单方法是使用良好验证的蛋白质印迹抗体。当可能时,优先选择识别出朝向预期吲哚的n-末端的表位的抗体,以检测是否表达截短形式的蛋白质。

基因编辑实验的实验对照

与任何其他实验设计一样,应支付考虑以确保强大的控制到位。每个实验应包括对照,并联运行,并具有相同的试剂。基因编辑实验的两个基本对照可以分组为正且阴性。

负面控制

阴性对照表明观察到的变化是引入的突变的直接结果,而不是由于其他非特异性效果。典型的阴性对照包括所有必要的CRISPR试剂,用于进行基因编辑,但使用在实验系统中不识别任何序列的GRNA。从Sigma-Aldrich获得,已经设计不瞄准人,大鼠或小鼠基因组中任何区域的货架阴性对照®文件夹。

阳性控制

阳性控制表明,使用的CRISPR试剂和递送方法在您的实验设置中正常工作。这对于实验产生负面结果(或未观察到的变化),这是重要的,因为它允许您确认这不是由于您的实验设计。典型的阳性对照包括所有必要的CRISPR试剂所需的所有必要的CRISPR试剂以及先前已被证明在系统中成功靶向另一个基因的GRNA所需的Gene编辑。我们提供以各种交付格式的一系列已验证的控件可用于验证您的CRISPR系统。

CRISPR验证总结了

一个良好构思的CRISPR实验包括强大的验证和控制计划。根据需要,对两个基因编辑和表达丧失的正确验证将显着提高您识别潜在问题并纠正的能力。

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参考

  1. 哦,核糖核苷蛋白转染在初级T细胞中的CRISPR / CAS9介导的基因敲除Curr Protoc免疫素。124(1):E69(2019)。DOI:10.1002 / CPIM.69。EPUB 2018年10月18日。
  2. Kosicki,M.各种CRISPR / CAS9递送方法诱导的诱导诱导的动态PROG MOL BIOL晶片SCI。152,49-67(2017)。DOI:10.1016 / BS.PMBTS.2017.09.003
  3. 邱,P.使用测量仪™核酸酶进行突变检测生物技术,36(4),702-7(2004)。DOI:10.2144 / 04364PF01
  4. Germini,D,评估基因组编辑效果的技术比较趋势生物技术。36(2),147-159(2018)。DOI:10.1016 / J.TibTech.2017.10.008
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