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如何理解CRISPR格式及其应用程序

内容由Sigma-Aldrich®高级基因组学

DNA被修饰,使用工具表示修饰的CRISPR核酸酶的格式

CRISPR基因编辑系统的主要组分是细菌衍生的核酸酶(例如CAS9)和引导RNA(GRNA)。这个相对简单的系统被证明是非常多样的。通过多种修改,研究人员已经过修改CRISPR核酸酶格式可用于各种研究,包括基因敲除/敲入,激活,抑制和表观遗传修饰。结果是一个工具箱,使科学家能够在超出系统范围内执行超出基因编辑和调制实验的宽度ZFNS.或Talens。

本文综述了一般CRISPR/Cas体系,讨论了两种最重要的替代形式-镍酶和催化死核酸酶-及其在研究中的应用。

CRISPR核酸酶系统

CRISPR系统包括GRNA和CAS核酸酶,其共同形成核糖核蛋白(RNP)复合物(图1)。该RNP靶向并切割特异性DNA序列。RNP的特异性由GRNA提供,由两部分组成:

  1. CRISPR RNA(CRRNA),其中包含原创化器;一种17-20个核苷酸序列,其被设计为与所需的靶DNA互补并引导RNP-DNA结合特异性。
  2. 逆激活CRRNA(TRACRRNA),其与CAS核酸酶结合。
CRISPR复合地层的示意图和双链断裂的产生。

图1所示。CRISPR组件示意图,展示了RNP的组成,以及它如何创造一个双链断裂,并被宿主细胞DNA修复机制修复。信贷:SigmaAldrich.com/CRISPR

虽然GRNA需要将RNP复合物指向靶DNA,但是通过RNP络合物成功结合和切割DNA是不足的。在靶序列的下游还需要存在短序列的DNA序列的存在短序列,称为原体晶体(PAM)。在该PAM存在下,RNP复合物结合,并通过核酸酶的作用,切割靶DNA,产生双链断裂(DSB)。

各种各样的CRISPR核酸酶已经识别,每个识别不同的帕姆。最常用的,最广泛的可用,核酸酶是衍生自细菌的“野生类型”Cas9酿脓链球菌(SpCas9)。SpCas9识别目标序列直接下游的5 ' -NGG-3 '的PAM,位于基因组DNA的非目标链上

如果没有适合SpCas9的PAM用于期望的目标序列,则可能需要来自不同物种的Cas9。从其他细菌中分离出了几种不同的Cas9版本,发现这些版本可以识别不同的PAMs。例如,把Cas9隔离开来链球菌犬属(SCCAS9)认识到5'-NNG-3'的严格严格的PAM。[1] Cas9孤立弗朗西斯氏菌属novicidaFNCAS9.)像SPCAS9一样,识别为5'-ngg-3'的PAM,但是在'n'位置的偏好方面偏好于a,t或c。与SPCAS9相比,FNCAS9进行的DNA裂解被交错,这导致DBS后的5'突出。

改性CRISPR核酸酶格式

Crispr =

野生型CAS9变体的一个限制是它们具有低严格的DNA互补性,这可能导致偏离目标效果。为了补偿这一点,Cas9凹点已经设计成,产生单链断裂(刻痕,可以由细胞机械修复)而不是双链断裂。例如,研究人员已经介绍了一种D10A点突变,其在SPCAS9中灭活Ruvc核酸酶域,因此工程化酸酐酶只能切割目标链[2]。

因此,为了产生双链断裂(DSB),两种不同但相邻的GRNA与配对旁滴(图2)一起使用。这种方法有效地消除了偏离目标效果的可能性,因为Cas9缩口都必须缩小其目标以产生DSB。

CrispRup配对乳酸的原理图如何产生双线断裂。

图2.用粘性末端使用配对克切碱基如何使用粘合末端进行双链断裂的图。

此外,当使用两个Cas9缩乳时,代替钝端,产生甚至可以对基因插入和集成的更大控制来产生粘性末端。此功能使CRISPR缩短了一种用于治疗应用中的基因编辑的理想系统。事实上,尼克酶已经用于初级T细胞中的基因组编辑,以及人类中的病毒DNA(例如,乙型肝炎病毒,HBV)的切除[3]。

Nuclease-deficient Cas9

Cas9的核酸酶缺陷版本(dCas9)已经设计成催化不活跃。虽然DCAS9不能切割DNA,但它保持精确靶向DNA的能力,使其能够作为基因组中的特定序列作为货物输送系统。目前用于DCAS9的范围从基因激活和对表观遗传修饰的干扰。在这里,我们探索了其中一些实现

CRISPR激活

CRISPR激活(CRISPRa)使用一种改良的CRISPR-dCas9系统,该系统包括附着在dCas9或gRNA上的转录激活物,以增加靶基因的表达。大多数CRISPRa系统使用融合在聚合病毒反转录域VP64上的dCas9(图3)。合成的转录因子随后被gRNA定位到特定的启动子序列上。将RNP与其他共激活子(如p65和HSF1)偶联,可以进一步提高CRISPRa系统[4]的效力。

Crispra和Crispri的示意图。

图3。CRISPRa和CRISPRi的示意图。信贷:SigmaAldrich.com/CRISPR

一个例子CRISPR基因激活称为CRISPR SAM(增效激活介质)。该平台结合了VP64-dCas9和修改后的指南。gRNA包含两个适配体,它们可以招募额外的共激活因子p65和HSF1,从而增强靶基因的活化(见图3)。这种SAM已被证明可以将复杂靶基因OCT4的表达增加数百倍于[5]。

通过富集对表型的不同基因进行富集,还可以作为函数丧失(LOF)遗传筛魂的互补方法[3]。Crispra屏幕显示很少没有偏离目标活动,可用于研究难以使用LOF方法表征的基因,因为它们的高拷贝数。此主题在此处更详细地介绍。

CRISPR干扰

CRISPR干扰(CRISPRI)提供了一种高效的沉默基因的方法而不改变底层DNA序列。CRISPRI系统基于与转录阻遏物融合的DCAS9,例如良好表征的KRÜPPEL相关框(KRAB)域(见图3)。Krab募集蛋白质,导致围绕靶DNA(例如DNA甲基化)的表观遗传抑制。当靶向基因的启动子时,该活性可防止招募转录机械,有效地沉默基因功能。

kab - dcas9 CRISPRi系统已被用于成功地沉默非分裂神经元中的遗传成分,这是众所周知的难以在基因组水平[6]编辑。与其他传统的基因沉默方法(如RNA干扰(RNAi)[7])相比,CRISPRi表现出更好的靶向特异性。

CRISPR表观遗传修饰符

除了表达调控外,CRISPR-Cas9还可用于对目标DNA进行表观遗传修饰,使研究人员可以直接研究表观基因组。表观遗传效应因子,如组蛋白乙酰转移酶,可以针对感兴趣的基因来研究这些位点的表观遗传控制,并以更自然的方式诱导或抑制表达。

一个例子是DCAS9-P300 CRISPR基因激活剂系统。这使用人P300蛋白的催化组蛋白乙酰转移酶结构域来解开DNA,从而允许基因表达的内源性活化。在实践中,在使用P300-DCAS9激活时,OCT4转录水平已增加至少两倍[8]。

基于crispr的表观基因组修饰也可用于高通量筛选,以识别和研究特定基因座[9]的功能调节元件。

修饰的CRISPR核酸酶格式摘要

CRISPR基因编辑系统提供了一系列工具,以以几种互补方式研究基因表达。CAS9的工程版本允许有效地减少或消除野生型CAS9的潜在脱靶效果(通过ESPCAS9或CAS9℃),并且具有对基因功能无关调节的特定效用。

此外,DCAS9,当与表观遗传改性剂结合时,已经打开了外形内蛋白酶以直接询问和操纵。

如果你想了解更多关于CRISPR系统的信息,你可以在我们的相关CRISPR资源中找到更多信息。

更多CrisPr的资源

CRISPR文章

CRISPR网络研讨会

CRISPREBEB.

CRISPR基因编辑101

CRISPR工具

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参考

  1. Chatterjee,P。极小相似的SPCAS9 Ortholog的PAM特异性SCI ADV..10月;4(10)(2018)。DOI: 10.1126 / sciadv.aau0766
  2. 兰伯蒂,J.具有配对CRAP-CAS9酸酐核糖蛋白的人体细胞中高效和特异性的基因组编辑生物奇(2019)DOI:10.1101 / 766493
  3. karimova,m。CRISPR/Cas9 nickase介导的乙型肝炎病毒开放阅读框S和X的破坏科学培训13734(2015)。DOI: 10.1038 / srep13734
  4. 查韦斯,A。Cas9激活剂在多种物种中的比较NAT方法13(7),563-567(2016年)。DOI:10.1038 / nmeth.3871
  5. Konermann, S。由工程式CRISPR-CAS9复合物的基因组规模转录激活自然517年,583 - 8(2015)。DOI: 10.1038 / nature14136
  6. 郑,Y.基于CRISPR干扰的大脑特异高效的基因失活Nat Neurosci.21,447-54(2018)。DOI:10.1038 / S41593-018-0077-5
  7. Kampmann,M.哺乳动物细胞中Crispri和Crispra屏幕进行精密生物学和药物ACS Chem Biol.13(2), 406-416(2018)。DOI: 10.1021 / acschembio.7b00657
  8. 吉,问:工程化Zing-Finger转录因子激活Oct4(POU5F1),SOX2,KLF4,C-MYC(MYC)和MIR302 / 367核酸研究42(10),6158-67(2014)。DOI:10.1093 / NAR / GKU243
  9. 克兰,T。CRISPR-Cas9表观基因组编辑使人类基因组功能调节元件的高通量筛选成为可能生物科技Nat》35.,561-568(2017年)。DOI:10.1038 / NBT.3853
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