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如何理解CRISPR格式及其应用

内容由Sigma-Aldrich®高级基因组学

DNA被修改使用工具来表示修改的CRISPR核酸酶格式

CRISPR基因编辑系统的主要组分是细菌衍生的核酸酶(例如CAS9)和引导RNA(GRNA)。这个相对简单的系统被证明是非常多样的。通过多种修改,研究人员已经过修改CRISPR核酸酶格式这可以用于多种研究,包括基因敲除/敲入、激活、抑制和表观遗传修饰。其结果是一个工具箱,使科学家能够执行广泛的基因编辑和调制实验,超出了类似系统的能力范围ZFNs或取得。

在这里,我们回顾了一般的CRISPR/Cas系统,讨论了两种最重要的替代格式-尼克酶和催化死亡核酸酶-及其在研究中的应用。

CRISPR核酸酶系统

CRISPR系统包括一个gRNA和一个Cas核酸酶,它们一起形成一个核糖核蛋白(RNP)复合体(图1)。RNP以特定的DNA序列为靶标,并切割特定的DNA序列。RNP的特异性由gRNA提供,gRNA由两部分组成:

  1. CRISPR RNA(CRRNA),其中包含原创化器;一种17-20个核苷酸序列,其被设计为与所需的靶DNA互补并引导RNP-DNA结合特异性。
  2. 反式激活crRNA (tracrRNA),它与Cas核酸酶结合。
CRISPR复合物的形成和双链断裂的生成示意图。

图1所示。CRISPR组件的示意图,展示了RNP的组成,以及它是如何产生被宿主细胞DNA修复机制修复的双链断裂。信贷:SigmaAldrich.com/CRISPR

虽然GRNA需要将RNP复合物指向靶DNA,但是通过RNP络合物成功结合和切割DNA是不足的。在靶序列的下游还需要存在短序列的DNA序列的存在短序列,称为原体晶体(PAM)。在该PAM存在下,RNP复合物结合,并通过核酸酶的作用,切割靶DNA,产生双链断裂(DSB)。

各种各样的CRISPR核酸酶已经识别,每个识别不同的帕姆。最常用的,最广泛的可用,核酸酶是衍生自细菌的“野生类型”Cas9酿脓链球菌(SpCas9)。SpCas9可以识别目标序列下游5 ' -NGG-3 '的PAM,位于基因组DNA的非目标链上

如果SpCas9的合适PAM不能用于所需的目标序列,则可能需要来自不同物种的Cas9。从其他细菌中分离出了几种不同的Cas9版本,并发现它们可以识别不同的PAMs。例如,Cas9从链球菌犬属(ScCas9)识别5 ' -NNG-3 '的较不严格的PAM。[1] Cas9从弗朗西斯氏菌属novicida(FNCAS9.),像SpCas9一样,识别5 ' -NGG-3 '的PAM,但在' N '位置优先选择a、T或C。与SpCas9不同的是,FnCas9的DNA切割是交错的,这导致DBS后5 '的悬垂。

改性CRISPR核酸酶格式

CRISPR nickas

野生型Cas9变异体的一个局限性是,它们的DNA互补性较低,这可能导致脱靶效应。为了弥补这一缺陷,Cas9尼克酶被设计成单链断裂(可以通过细胞机制修复的断裂)而不是双链断裂。例如,研究人员引入了一个D10A点突变,使SpCas9中的RuvC核酸酶结构域失活,因此,改造的nickase只能切割目标链[2]。

因此,为了产生双链断裂(DSB),两个不同但相邻的grna与配对的nickase一起使用(图2)。这种方法有效地消除了脱靶效应的可能性,因为两个Cas9 nickase都必须在各自的靶标处产生DSB。

CRISPR配对尼克酶如何产生双链断裂的原理图。

图2。图示如何使用成对的nickase创建具有内聚末端的双链断裂。

此外,当使用两个Cas9缩乳时,代替钝端,产生甚至可以对基因插入和集成的更大控制来产生粘性末端。此功能使CRISPR缩短了一种用于治疗应用中的基因编辑的理想系统。事实上,尼克酶已经用于初级T细胞中的基因组编辑,以及人类中的病毒DNA(例如,乙型肝炎病毒,HBV)的切除[3]。

Nuclease-deficient Cas9

Cas9的核酸酶缺陷版本(dCas9)已被设计成无催化活性。虽然dCas9不能切割DNA,但它保持了精确定位DNA的能力,使其能够作为一种货物运输系统,向基因组中的特定序列输送。目前dCas9的应用范围从基因激活和干扰到表观遗传修饰。这里我们将探索其中的一些实现

CRISPR激活

CRISPR激活(CRISPRa)使用了一种改良的CRISPR-dCas9系统,其中包括附着在dCas9或gRNA上的转录激活因子,以增加目标基因的表达。大多数CRISPRa系统使用融合到聚合病毒转激活域VP64的dCas9(图3)。然后合成的转录因子通过gRNA指向特定的启动子序列。RNP与p65和HSF1等额外的共激活因子结合,进一步增强了CRISPRa系统[4]的效力。

Crispra和Crispri的示意图。

图3。CRISPRa和CRISPRi的示意图。信贷:SigmaAldrich.com/CRISPR

CRISPRa的一个例子被称为CRISPR SAM(协同激活介质)。这个平台结合了VP64-dCas9和一个修改过的指南。gRNA包含两个适配体,招募额外的共激活因子p65和HSF1,增强靶基因的激活(见图3)。这种SAM已被证明能使OCT4等困难靶标的表达增加数百倍[5]。

CRISPRa也可以作为一种功能缺失(LOF)基因筛选的补充方法,通过富集一组不同的基因负责表型[3]。CRISPRa筛选显示很少或没有脱靶活性,可以用于研究仅使用LOF方法难以描述的基因,因为它们的拷贝数很高。这里将详细介绍这个主题。

CRISPR干扰

CRISPR干扰(CRISPRI)提供了沉默基因的高效方法而不改变底层DNA序列。CRISPRI系统基于与转录阻遏物融合的DCAS9,例如良好表征的KRÜPPEL相关框(KRAB)域(见图3)。Krab募集蛋白质,导致围绕靶DNA(例如DNA甲基化)的表观遗传抑制。当靶向基因的启动子时,该活性可防止招募转录机械,有效地沉默基因功能。

krabb - dcas9 CRISPRi系统已被用于成功沉默非分裂神经元中的遗传成分,众所周知,这些遗传成分很难在基因组水平[6]上编辑。CRISPRi比其他传统的基因沉默方法如RNA干扰(RNAi)[7]表现出更好的靶向特异性。

CRISPR表观遗传修饰符

除了表达调控,CRISPR-Cas9还可以对靶向DNA进行表观遗传修饰,使研究人员可以直接研究表观基因组。表观遗传效应因子,如组蛋白乙酰转移酶,可以靶向相关基因,以研究这些位点的表观遗传控制,并以更自然的方式诱导或抑制表达。

一个例子是dCas9-p300 CRISPR基因激活物系统。这种方法利用人p300蛋白的组蛋白乙酰转移酶催化结构域来解开DNA,从而允许内源性的基因表达激活。在实践中,使用p300-dCas9[8]激活OCT4转录本水平至少增加了两倍。

基于crispr的表观基因组修饰也可用于高通量筛选,以识别和研究特定位点[9]的功能调控元件。

改良CRISPR核酸酶格式综述

CRISPR基因编辑系统提供了一系列工具,以几种互补的方式研究基因表达。基因工程版本的Cas9可以有效地减少或消除野生型Cas9潜在的脱靶效应(通过eSpCas9或Cas9-nickases),并对非核酸酶调控基因功能具有特异性的效用。

此外,DCAS9,当与表观遗传改性剂结合时,已经打开了外形内蛋白酶以直接询问和操纵。

如果你想了解更多关于CRISPR系统的信息,你可以在我们相关的CRISPR资源中找到更多信息。

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参考

  1. Chatterjee, P。与SpCas9同源基因高度相似的PAM特异性极小Sci副词。10月;4(10)(2018)。DOI: 10.1126 / sciadv.aau0766
  2. 兰博斯,J。具有配对CRAP-CAS9酸酐核糖蛋白的人体细胞中高效和特异性的基因组编辑BioRxiv(2019)DOI:10.1101 / 766493
  3. Karimova, M。CRISPR/Cas9 nickase介导的乙型肝炎病毒开放阅读框S和X的破坏Sci代表13734(2015)。DOI: 10.1038 / srep13734
  4. 查韦斯。多物种Cas9激活物的比较NAT方法13(7),563-567(2016年)。DOI:10.1038 / nmeth.3871
  5. Konermann, S。基因尺度的转录激活由一个工程CRISPR-Cas9复合体自然517年,583 - 8(2015)。DOI: 10.1038 / nature14136
  6. 郑,Y.基于CRISPR干涉的特定和有效的大脑基因失活Nat >21日447 - 54(2018)。DOI: 10.1038 / s41593 - 018 - 0077 - 5
  7. •卡普曼,M。CRISPRi和CRISPRa在哺乳动物细胞中进行精确的生物学和医学筛选ACS Chem Biol.13(2), 406-416(2018)。DOI: 10.1021 / acschembio.7b00657
  8. 霁,Q。重组的king -finger转录因子激活OCT4 (POU5F1)、SOX2、KLF4、c-MYC (MYC)和miR302/367核酸的研究42(10),6158-67(2014)。DOI:10.1093 / NAR / GKU243
  9. 克兰,T。CRISPR-Cas9表观基因组编辑能够高通量筛选人类基因组中的功能调控元件生物科技Nat》35, 561 - 568(2017)。DOI: 10.1038 / nbt.3853
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