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一种Crisprp的免疫肿瘤学方法

内容赞助Sigma-Aldrich®高级基因组学

T细胞和癌细胞的形象突出了CRISPR可以用于增强T细胞抗癌能力。

T细胞是适应性免疫应答中的中央球员,对抗癌症的关键作用。一些癌细胞操纵天然免疫检查点机制以逃避T细胞的检测。编程的死亡-1(PD-1)检查点受体是这样的例子,并且通过配体PD-L1的结合而被激活,这导致T细胞的灭活。许多癌症通过表达PD-L1配体响应免疫系统施加的选择性压力。

通过研究人员靶向并阻断PD-L1至PD-1的结合,已经开发了治疗抗体。阻断PD-1受体可防止PD-L1介导的T细胞失活。这种失活导致T细胞促进抗肿瘤活性,导致肿瘤学中的非常重要的靶标。虽然使用抗体可以是有效的疗法,但有局限性。[1]像CRISPR这样的基因编辑方法有可能克服这些限制。

T细胞的前体内编辑作为治疗策略

使用治疗性抗体的主要挑战是癌细胞在肿瘤进展期间癌细胞的免疫应答持续失活。这需要通过多轮治疗来持续补充抗体以实现所需的治疗结果。

一种更强大的解决方案是通过直接基因编辑患者的T细胞来破坏PD-1受体。这涉及提取T细胞,敲出PD-1受体,并将修饰的T细胞重新引入血液中(图1)。已经采用了几种基因编辑方法来实现免疫检查点抑制,包括锌手指核酸酶(ZFN),转录激活剂样效应核酸酶(缩略图),经常间隙的短语重复(CRISPRS.)。每个系统都具有优缺点。

CRISPR如何用于破坏患者T细胞中的PD-1受体。

图1. CRISPR可用于在重新引入患者之前破坏分离的患者T细胞中的PD-1受体。

基于CRISPR的基因编辑是安全的,具体的,易于使用和高效,使其成为治疗应用的特别有用的方法。研究已经表明该技术的承诺具有Crispr-介导的PD-1中断增强细胞毒性T淋巴细胞和汽车T细胞的抗肿瘤活性。[2,3]

重要的是要注意,没有必要在患者的血流中隔离和编辑治疗的每个细胞以使其有效。一旦活化,T细胞促进了,产生数百万个细胞,然后可以安装免疫应答。因此,只需要改变患者的总T细胞群的一小部分。

基因重编程T细胞的挑战

基于CRISPR的基因编辑,同时具有优于用于编辑主要细胞的其他方法,仍存在一些挑战。在这里,我们审查了一些主要障碍,包括递送方法,偏离目标效果和编辑效率。

T细胞中的递送方法

Crispr-介导的官能基因组学在初级T细胞中的应用主要是由于载体递送低效率和递送系统对细胞稳态上的不希望的影响。传统上使用病毒载体或基于质粒的递送方法进行CISPR-CAS9机械的递送到细胞中。最近的研究表明,虽然可以使用这两种方法在T细胞中实现CRISPR基因编辑,但它们的效率低于永生化细胞。[4-6]下面讨论这些方法中的每种方法的优点和挑战。

病毒介导的递送

慢病毒载体永久集成到宿主基因组中,这可能导致宿主细胞中CRISPR-CAS9机械的持续存在的偏离目标效果。其中慢病毒载体整合到宿主基因组中的随机性也可以产生不希望的和不可预测的副作用。

腺病毒(ADV)和腺相关病毒(AAV)载体可以克服随机整合的问题,因为它们没有集成到宿主基因组中。相反,它们存在于宿主细胞内的稳定血肉。但是,这些方法有自己的限制。

小尺寸的advs限制了可以在病毒内包装至约4.5kb的DNA的量。当使用相对较大的核酸酶SPCAS9时,这可能是有问题的。这可以通过使用替代Cas9蛋白,SACA9来克服,SACA9比SPCAS9小约70%。[8]

advs的主要缺点是他们众所周知,他们会引发先天和特异性免疫反应。虽然AAV不触发与ADVS所见的鲁棒免疫应答,但AAV的衣壳可以引发延迟的免疫应答,这会导致CD8 + T细胞毒性。[5]

除了上面列出的AAV和ADV的局限性之外,病毒矢量开发昂贵且耗时,使得难以在大规模的治疗环境中实现。

非病毒递送

在淋巴细胞中递送质粒的非病毒技术先前产生了差的结果。然而,将Cas9蛋白作为核糖核蛋白(RNP.)使用诸如电穿孔的非病毒方法的复合物在几项研究中显示成功[10,11]。由于毒性,大转基因的递送是原代细胞的特定问题。最近的一项研究已经克服了这个问题,显示CAS9 RNP可用于在初级T细胞基因组中的特定基因座中插入大于1千碱基的转基因,对细胞存活和功能没有有害影响。[12]

通过相关的进展,例如将CRISPRRNA(CRRNA)和转毒CRRNA(TRACRRNA)连接到单一导向RNA(SGRNA)中的相关前进,还提高了初级T细胞的产物也得到了改善,这减少了必须引入的组分数量目标细胞。

RNP复合物的递送对基于DNA的方法具有明显的优势,因为它不依赖于细胞表达机械,并且相对快速地除去,限制偏离目标效果的可能性。如果需要选择标记以分离编辑编辑的细胞群(例如,通过抗生素抗性或荧光标签),则使用RNP复合物的使用可能更加困难。然而,现在可以购买荧光的Cas9蛋白。

减少Crispr的偏离目标效果

使用核糖核苷蛋白复合物以最小化脱靶效应

当将细胞重新倾向到患者中时,偏离目标效果的最小化至关重要。使用RNP复合物可以限制这种不需要的效果。与通过慢病毒递送的构建体与集成到基因组,RNP复合物在靶细胞中仅存在瞬时存在。T细胞的快速蛋白质成交量在24小时内降解了这些CAS9 RNP络合物,[10]限制了时间CAS9活跃并减少偏移活动的机会。

用成对的凹口最小化偏离目标效果

限制偏离目标效果的另一种方法是使用配对昵称。在该技术中,使用工程化核酸酶的核酸酶,其可以仅切割一股DNA。对于用该系统发生双链切割,每个酸酶必须与靶向DNA的相同区域的互补导向(GRNA)配对。这使得偏离目标切口的概率如此之低,以至于它们被有效地消除。

交错裂解在最小化偏离目标效果方面的益处

与其他常用的CAS9核酸酶不同,例如孤立的CAS9核酸酶链球菌Pyogenes(SPCAS9)和金黄色葡萄球菌(SACAS9),RUVC核酸酶域Francisella诺维利达Cas9(FNCAS9.)以交错的图案切割靶DNA,在5'末端留下四个核苷酸突出,并且表现出更高的特异性。然而,FNCAS9不编辑人类基因组中的多个靶标,在某些哺乳动物染色质上下文中灭活。近端CRISPR靶向方法,也称为代理克里克克,[13]利用这种奇怪的FNCAS9特征。Proxy-Crisp以允许精确编辑的目标特定方式恢复FNCAS9的核酸酶功能,即使在同一基因组中的相同位点之间也是如此。使用FNCAS9,其内在更具体地比SPCAS9进一步降低了使用CRISPR系统的偏移效应的概率。

提高原代细胞的编辑效率

尽管CRISPR-CAS9系统在永生化细胞系中具有显着效率,但是即使使用相同的GRNA,基于CRISPR的基因组编辑也显着降低了T细胞的效率。[6]目前的数据表明,降低的效率由许多因素驱动,其中包括转染率,启动子相容性,外切核酸酶活性,在引入外来遗传物质后产生干扰素的差异以及人类DNA修复的高保真性主要细胞。已经设计了几种修改,以提高主要细胞中的CRISPR系统的编辑效率。

选择GRNA和编辑效率

在两部分合成GRNA系统中,通用TRACRRNA和特定CRRNA仍然分开。当这些组合成SGRNA时,已经显示编辑效率在初级人体细胞增加,包括未激活的T细胞。此外,最近的研究表明,化学改变的SGRNA在初级T细胞,造血干细胞和祖细胞中增加了它们的基因组编辑效果。[14]

研究表明,某些化学修饰增加了RNA的稳定性。[15, 16, 17] Building on those data, sgRNAs have been modified with 2′-O-thionocarbamate, 2′-O-methyl, 2′-O-methyl 3’phosphorothioate, or 2′-O-methyl 3′ thioPACE at multiple nucleotides at both ends. When introduced together with Cas9 (in the form of mRNA or RNP), modified sgRNAs offer a distinct advantage for gene editing in human cell lines and primary unstimulated T cells. It is worth noting that the efficacy of the specific chemical modification is dependent on the sequence, cell type, and delivery conditions.

RNP和编辑效率

除了改进的交付外,Cas9 RNP复合物在T细胞中表现出高编辑效率。使用髓蛋白转染这些复合物获得的目标截止率为90%[18],可以使用电穿孔进一步增强。改性的电穿孔方法在转染前不需要T细胞活化,因此可以用于在保持细胞活力的同时研究T细胞分化的研究。

结合RNP和配对镍酶以提高编辑效率

如上所述,配对乳酸的使用可以减少偏离目标效果。当作为配对尼氨酸的RNP复合物交付时,该方法具有高编辑效率的增加的益处。

与maxcyte合作,我们表明,在外周血单核细胞(PBMC)中,配对尼氨酸系统在5天内导致PD-1蛋白表达的> 80%降低。配对尼斯系统在比单一SPCAS9核酸酶系统更广泛的区域上展开它的诱导,导致更大的表型效果。CD8 + T细胞的其他临床相关靶标,例如CTLA4,TIM-3和TRAC也使用配对尼氨酸的RNP系统以高效率和特异性成功编辑。

结论

T细胞的基因编辑是一种强大的新型,有效的免疫肿瘤疗法工具。与任何新技术一样,在实施此工具时存在挑战,包括交付CRISPR机械,偏移效应的可能性以及低编辑效率。但是,可以通过仔细选择CRISPR机械和交付方式来克服这些问题。

有关使用配对酸酐rnps进行编辑T细胞的更详细信息,请退房我们的网络研讨会“高效和特异性的基因组编辑用CAS9镍核糖核蛋白在初级T细胞中“。

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参考

  1. Michot,J.M.,免疫相关不良事件免疫检查点封锁:全面审查欧j癌症。54:139-148(2016)。DOI:10.1016 / J.EJCA.2015.11.016。
  2. 赵,Z.Crispr淘汰程序的细胞死亡蛋白1增强细胞毒性T淋巴细胞的抗肿瘤活性onCotarget.。9(4):5208-5215(2017)。DOI:10.18632 / onCotarget.23730。
  3. Choi,B.D.,CRISPR-CAS9破坏PD-1的破坏增强了人胶质母细胞瘤的临床前模型中通用EGFRVIII CAR T细胞的活性J.Immun治疗癌症7,304(2019)。DOI:10.1186 / s40425-019-0806-7
  4. 李,C.使用腺病毒输送的CRAC / Cas9通过CCR5基因编辑抑制原发性CD4 + T细胞的HIV-1感染。J Gen Virol.96,2381-93(2015)。DOI:10.1099 / VIR.0.000139
  5. Samulski,RJ。AAV介导的研究和治疗目的的基因治疗Annu Rev Virol.1:427-51(2014)。DOI:10.1146 / Annurev-Virology-031413-085355
  6. Mandal,P.K.利用CRISPR / CAS9有效地消融人造血茎和效应细胞中的基因细胞干细胞15(5):643-52(2014)。DOI:10.1016 / J.Stem.2014.10.004。
  7. 吴,Z.,基因组大小对AAV矢量包装的影响摩尔蒂18:80-6(2010)。DOI:10.1038 / MT.2009.255
  8. 冉,f.a.,使用金黄色葡萄球菌Cas9的体内基因组编辑自然520:186-91(2015)。DOI:10.1038 / Nature14299
  9. Su,S。CRISPR-CAS9介导的癌症患者对人原发性T细胞有效的PD-1中断科学培训6,20070年(2016年)。DOI:10.1038 / SREP20070。
  10. 金,斯。,通过递送纯化的Cas9核糖蛋白,高效的RNA引导基因组在人体细胞中编辑基因组res.24,1012-9(2014)。DOI:10.1101 / GR.171322.113。
  11. 舒曼,K。使用Cas9核糖核蛋白生成敲入的原发性人T细胞pnas.112(33):10437-42(2015)。DOI:10.1073 / pnas.1512503112。
  12. 罗斯,T. L.用非病毒基因组靶向重编程人类T细胞功能和特异性自然559,405-409,(2018)。DOI:10.1038 / S41586-018-0326-5。
  13. 陈,F.通过近端CRISPR靶向对哺乳动物基因组进行各种CRISPR-CAS系统的有针对性的激活NAT CANCE8,14958(2017)。DOI:10.1038 / ncomms14958。
  14. Hendel,A.化学修饰的导向RNA增强人原代细胞中的CRISPR-CAS基因组NAT BIOTECHNOL.33,985-9(2015)。DOI:10.1038 / NBT.3290。
  15. deleavey gf和damha mj。设计化学改性寡核苷酸的靶向基因沉默化学。BIOL.19:937-954(2012)。DOI:10.1016 / J.Chembiol.2012.07.011
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  17. Dellinger,D.J.,膦酸乙酯和硫代磷酸寡核苷酸的固相化学合成J.IM。化学。SOC。125:940-950(2003)。DOI:10.1021 / JA027983F
  18. 哦,答:,核糖核苷蛋白转染在初级T细胞中的CRISPR / CAS9介导的基因敲除Curr Protoc免疫素124,E69(2019)。DOI:10.1002 / CPIM.69

T细胞和癌细胞的形象突出了CRISPR可以用于增强T细胞抗癌能力。

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