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为什么要考虑将CrisPra和Crispri添加到您的工具箱中

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DNA转霉病的图像显示Crispr如何使用Crispra和Crispri来修饰基因表达

CRISPR / CAS9基因编辑已成为通过在靶向基因组基因座的双链断裂产生永久性函数(LOF)突变的越来越流行的解决方案,之后内源细胞机械修理切割的DNA。LOF源于这种修复过程中的框架突变的引入。CRISPR / CAS9系统的适应扩展了该技术的应用,允许CRISPR介导的基因活化(CRISPRA)和抑制(CRISPRI)而不改变DNA。

Crispra多么努力工作

与常规CRISPR / CAS9基因编辑相比,CrisPra和Crispri采用Cas9(DCAS9)的催化活性形式。该CAS9变体具有两个氨基酸残基,D10a和H840a中的点突变,其分别去激活Cas9的Ruvc和HNH核酸酶结构域。[1]尽管DCAS9不能切割DNA,但仍然通过引导RNA(GRNA)精确地募集到靶DNA。合成生物学家通过构建基于DCAS9的工具来利用DCAS9的这种特性,该工具扩展CRISPR / CAS9系统的功能。

DCAS9可以通过熔化或以其他方式募集适当的转录效应域至无活性核酸酶(图1)转录到转录活化剂或阻遏物中。常用的转录活化剂结构域包括VP64,NF-αb的P65结构域,Epstein Barr病毒R反式激活器(RTA)和用于热冲击因子1的活化剂结构域(HSF1)。[2]与DCAS9组合使用的主要转录阻遏物是来自KOX1的Krüppel相关框(Krab)域。[3]

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图1. Crispri和Crispra利用催化活性的Cas9和转录激活剂和阻遏物调节基因表达。

在内源性上下文中,多种转录因子和辅助因子的同步工作以刺激基因转录。实际上,CrisPra工具招募多个独特的转录激活因子,以促进者优于带有单个转录激活域或相同效应器的冗余副本的启动子。[4,5]靶向同一启动子上的多个位点也增加了Crispra的基因活化。[5]最有效的CRISPRA效应器是CRISPR协同激活介质(SAM)复合物,其向靶向基因启动子招募三个独特的转录激活域。在该系统中,一个转录激活剂VP64(VP16的多端形式)直接融合到DCAS9。蛋白质结合的RNA适体,工程化入GRNA的茎环区域募集其他两个转录活化剂结构域。[5] CRISPRI和CRISPRA复合物只需要与适当设计的GRNA一起表达,以诱导哺乳动物细胞中的CRISPRI或CRISPRA。

设计CRISPRA或CRISPRI实验的考虑因素

如何设计GRNA

GRNA的设计在Crispra或Crypri和Crispr kO之间不同,其中蛋白质编码基因中的效率靶向早期外显子,以防止截短蛋白质可以保留一些功能。围绕49个基因的转录开始站点(TSS)的所有可能GRNA的屏幕使得能够识别克里普利和CRISPRA的最佳靶向窗口。[6]

与其双重动作机制一致,使用DCAS9-Krab阻遏物的CRISPRI对于从每个TS的窗口中落入窗口的GRNA有高效的GRNA,并以最佳性能的GRNA瞄准前100bp在TSS的下游。对于Crispra来说,从单独的TSS跨越-400至-50bp的窗口被确定为最佳靶向区域。[6]此窗口适用于所有Crispra效果,包括SAM系统。[5]

由于CRISPRa或CRISPRi gRNA的有效性受到目标基因TSS的接近程度的影响,这意味着CRISPRa或CRISPRi的gRNA设计对于注释较差的基因组来说更加复杂。gRNAs对CRISPRa或CRISPRi的效力降低的原因是:

  • 长度原貌长度(> 21 bp)。
  • 在原始旋流器区中存在核苷酸均聚物(例如,AAAA或GGGG)。

此外,围绕靶向基因组区域的染色质环境可以限制核酸酶进入该部位。[7]

鉴定高活性GRNA对于构建基因组规模的CRIPRI和CRISPRA文库至关重要。这些文库包括每种基因3-10克,以确保筛选击中不是因为GRNA效率不足。[8,9]汇集的GRNA屏幕提供了一种坚固且直接的方法,用于澄清各种因素影响GRNA活性,可以用相对最小的努力来测试数千个GRNA。[10]

汇集GRNA屏幕还通知GRNA预测算法。观察结果,例如GRNA序列,位置和可访问性的影响,使高活性GRNA的迭代和综合识别能够。[11,12]这导致了高活性和紧凑的(即,每种基因较少的GRNA)GRNA文库,用于CRISPRI和CRISPRA。[9]最终,紧凑型CRISPR库减少了执行基因组尺度屏幕所需的细胞数量。

Sigma-Aldrich®功能基因组学解决方案套件包括针对Crispri和Crispra的优化,全基因组GRNA文库以及个人目标和大规模图书馆的定制GRNA设计服务。发现汇集CrisPra筛选的详细协议

与竞争技术相比,Crispra和Crispri

CRICRI和CRISPRA的机制与其他基因扰动技术不同,如RNA干扰(RNAi)和CRISPR KO(图2)。这些差异提供了在选择实施哪种技术时应考虑的优缺点和挑战。

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图2.与RNAI和CRISPR KO相比CRISPRA和CRISPRI的机制。

CRISPRI与RNAi.

Crispri机制与其他基因扰动技术不同,如RNA干扰(RNAi)。通过利用保守的RNA处理途径来抑制基因表达,以降解细胞质中的靶向mRNA。通过RNAi选择内源性机械的细胞质位置可防止其有效地靶向核RNA,例如NCRNA。[13] RNAi还可以通过从RISC置换内源性小RNA(例如,MicroRNA)来诱导偏移靶向效应。[14] Crispri避免了这些不需要的效果,因为所有组分都来自外源源。最后,Crispri通过产生更强大的偏离目标效果的强大表型来实现大规模筛选应用中的RNAi。[6]

CRISPRI与CRISPR KO

尽管CRISPR基因编辑是一种产生LOF突变体的强大方法,但一些缺点阻碍了它在所有的LOF研究中使用。Cas9引起的双链断裂可以诱导细胞毒性和基因组不稳定,特别是在癌细胞系中。此外,大约有三分之一的indels不会引起必要的移码来敲除目标基因。非编码区域(如长链非编码rna)很难被Cas9靶向,因为它们需要在两个位点进行编辑才能产生足够大的突变来产生LOF。[17] CRISPR KO也是一种次优方案,用于研究那些在全基因组筛选中无法识别的、对细胞生存至关重要的基因的影响,因为细胞可以耐受这些基因的部分敲除,而不是完全敲除。通过不切割DNA, CRISPRi规避了CRISPR KO的缺点,使其成为干扰非编码基因或要求可逆或可滴定的应用程序的最佳选择。

Crispra vs. Orf过表达

CRISPRA提供了超过现有功能增益(GOF)技术的一些优点,例如开放阅读框(ORF)过表达。ORF的过度表达通常利用具有导致超级病表达水平的强病毒启动子(例如,CMV)。由于CrisPra靶向内源性基因启动子,因此求致致力于实现挑战性,使得Crispra更适合有利于靶向基因的生理或接近生理表达的应用。[18]这也意味着Crispra更容易上调靶向基因的最相关的剪接变体,特别是在它们未知的情况下。最后,基因组级ORF文库比同等缩放的CrisPra文库更难以合成。

CRISPRI和CRISPRA通过向复杂的生物过程提供互补的见解,增加了现有的基因组工程技术套件。与Crispr KO不同,它提供二元和永久性结果,Crispra和Crispri可用于可逆滴定滴定的基因表达水平(高达和超过1,000倍)。[2]此外,大规模的LOF和GOF屏幕可以识别唯一,但在功能相关的筛选参数下的唯一且功能相关的位置。SPI1(通过CRISPRA)和GATA1(通过CRISPRI)作为K562人髓性白血病细胞系中细胞生长调节剂的鉴定突出了这种并行使用CRISPRI和CRISPRA的有用性。[6]两种操作都会增加K562细胞中细胞生长,确认SPI1对GATA1活性的已知抑制作用。[19]因此,虽然各个CRISPR屏幕是独立强大的工具,但是当组合使用CRISPRI,CRISPRA和传统的CRISPR KO屏幕时提供强大的验证和加强调查结果,并提供对基因途径的更详细了解。

如何进行CRISPRA或CRISPRI实验

典型的Crispra或Crispri实验涉及三个必要的步骤:

  1. 理想地,产生具有适当的Crispra或Crispri构建体的改性Cas9的稳定细胞系。
  2. 递送GRNA。
  3. 分析结果。

以下是以下步骤的简要概述;这里可以提供更全面的协议

一代辅助细胞系

所有组分的瞬时转染足以用于有效转染的细胞系(例如,HEK293细胞),而携带型致丧失的转导在各种细胞系中提供更一致和鲁棒的结果。对于大规模的筛选应用,创建稳定的“辅助”细胞系,即在开始时表达DCAS9-Krab或CRISPR SAM复合体允许在筛选过程结束时快速验证。Sigma-Aldrich®.慢病毒载体可用于辅助单元生产线优化以改善功能性病毒滴度

GRNA交付

GRNA的慢病毒转导,然后进行抗生素选择,确保对小型和大规​​模应用的一致和鲁棒的激活或抑制。慢病毒交付对于汇集CRISPR屏幕至关重要,因为基因组 - 集成的GRNA序列用作后来的碎片折叠的条形码。因此,汇总的CRISPR库应以低(<0.7)多重感染,以确保每个细胞仅接收单个CRISPR副本。[8]

分析

对于小规模应用,分析涉及使用定量聚合酶链反应(QPCR)和Western印迹以及这些变化的功能后果测量mRNA和蛋白质水平的变化。汇集CRISPR屏幕使用下一代测序来分析选择过程后借助转导GRNA表示的变化。

Crispra和Crispri的应用

CrisPra和Crispri尤其适用于基因组和亚基因级筛选应用,包括鉴定药物靶标[20]和介导药物抗性的细胞因子,[5]由于可以合成GRNA文库的相对易于容易,并且和克隆包装在慢病毒。[6,5] CrisPra和Crispri也可以进行排列的筛选。两个Sigmaaldrich®网络研讨会提供更多的洞察力Crispr筛选包括全基因组的效益功能筛选Crispra,Crispri和Crispr ko屏幕之间的差异

虽然汇集CRISPR筛选在阵列筛选方面具有许多优点,但通常仅限于研究粗表型,例如细胞生长和活力。相比之下,几乎可以在阵列屏幕中完成任何类型的分析,因为在微量滴定板的各个井中发生了CRISPR扰动。然而,单细胞RNA测序的出现提供了高含量的转录组分析,可以集成到集合的CRISPR屏幕工作流中。这是因为每个CRISPR扰动,包括其转录组和表型效应都被限制在个体细胞上。因此,只要单个细胞可以分离,就可以与转录组读出以及表型结果连接。CRISPR单细胞筛选在Sigma-Aldrich®Portfolio中可以获得与10X基因组学的合作关系。

Crispra可用于研究基因的非编码基因[6]或单个转录物变体,[22]虽然注释的基因组对这些应用至关重要。CRISPRI也能够区分不同的转录变体,与CRISPR KO和RNAi不同,只要映射每个变体的TSS。

Crispra和Crispri工具总结了

Crispra和Crispri是用于以可逆和可滴定的方式调节基因表达的有效工具。这些技术使用DCAS9通过募集基因启动子和增强剂的内源转录活化剂和阻遏物复合物来充当合成转录因子,导致升高或下调的基因转录。CRISPRI在没有RNAI和CRISPR KO的局限性的情况下实现了LOF表型,并且CRISPRA为大规模过表达屏幕提供了可扩展的解决方案。虽然CrisPra和Crispri通常依赖于Lentivirus的递送,但这些技术为基因组工程提供了新的可能性。CRISPRI和CRISPRA可以单独使用,靶向其他基因扰动技术(例如,非编码区)或结合揭示离散表型的基因调节网络而无法访问的基因组的目标区域。最后,合并的CRISPRI和CRISPRA筛选可以与单细胞RNA-SEQ配对,以实现CRISPR扰动的高维表征。

更多CrisPr的资源

CRISPR文章

CRISPR网络研讨会

CRISPREBEB.

CRISPR基因编辑101(电子书)

CRISPR工具

您还应该考虑以下SigmaAldrich®工具:

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参考文献

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