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修改SiRNA改进RNAi的五种方法

五个修理官工作表示五种修改

尽管CRISPR / CAS基因组工程的普及程度不断增加,但RNA干扰(RNAi)仍然是生活科学家工具箱中的广泛使用的工具(在这里刷rnai的机制)。事实上,RNAI最近通过批准Patisiran的批准,罕见的治疗诊所,罕见的神经病变与遗传性的遗传性Transthyretin淀粉样蛋白病相关。[1]如果不是不可能的话,这种壮举将更加困难,如果不是发现和优化改善siRNA疗效的化学修饰。研究人员越来越多地青睐的化学修饰,以改善核酸酶抗性能力和递送siRNA,同时减轻其免疫原性(即,它们挑起免疫应答的倾向)。

为了说明可以对siRNA进行的化学修饰的类型,让我们首先看一下RNA的基本结构。图1描绘了通过磷酸二酯键连接在一起的两种核糖核苷。以颜色显示的是可以化学修改的网站。这些包括磷酸酯骨架(橙色),碱(洋红色),糖(绿色)和5'/ 3'-共价修饰(x,蓝色)的非酯基团。这些是化学修改siRNA的五种方法(最后类别被计算两次以考虑不同类型的共轭)。

修改SiRNA改进RNAi的五种方法 

图1. RNA化学结构包含通过磷酸二酯键连接的核糖核苷。

1. Termini修改

化学修饰siRNA最常见的方法是通过磷酸化反义链的5'末端。缺乏5'磷酸盐在本网站上的磷酸盐群体不受Arconaute 2(前2)的识别,RISC(RNA诱导的沉默复合体)机械的关键组成部分介导RNAi。但是,如果您自己不磷酸化这一关键网站,请不要担心;细胞会为您做。[2] Note though that, in general, heavily modified siRNAs can make poor substrates for intracellular kinases, [3] an obstacle that can be overcome by using 5’-phosphate analogs that cannot be hydrolyzed, such as 5’-(E)-vinyl-phosphonate. [4]

2.骨干修改

已经显示出连续核糖核苷的磷酸二酯基团提高稳定性和体内sirnas的生物利用度[4]。磷酸二酯键的非酯基(-OH,= O;图1中的有色橙色,可以用硫,硼或乙酸酯代替,得到硫代磷酸酯,硼磷酸盐和膦酰基乙酸盐键。

硫代磷酸酯,硼磷酸盐和膦酰乙酸键稳定SIRNA,因为它们易受外部和内切核酸酶水解的影响。然而,硫代磷酸酯和膦酰基乙酸键需要谨慎使用,因为它们可以通过抑制其装载到RISC机械来削弱SIRNA的效力。[4]它们还可以使SIRNA更有可能结合免疫受体,使其更免疫原性。另一方面,硼磷酸酯键是难以通过化学方法合成的。[4]

用磷酸二氢酯代替磷酸二酯基团促进胚胎的细胞吸收并通过消除它们的负电荷来保留血清组分。[6]这特别有用体内siRNA递送,因为它增加了循环中SIRNA的半衰期。此外,该修饰有效地将小干扰核糖核酸[siRNA]转化为小干扰核糖核核中性液[sirnns],因为第三酯的掺入去除连锁的负电荷。一旦在细胞内,酯酶就取出第三酯,将sirnns转换回siRNA。[7]

3.糖修改

当核糖糖被审驳(由外核酸酶催化的反应)时,2'-羟基(2'-OH)基团(图1中的有色绿色)可以用作亲核试剂并在磷酸二酯键中攻击相邻的磷。这就是改变磷酸二酯键改善siRNA的稳定性的原因 - 通过保护它们免受邻近的去质子糖的亲核攻击来保护它们。

而不是改变磷酸二酯键,以使其易于敏感的亲核攻击,而是通过用较少的亲核(即,不太可能捐献电子的物质)来替换核糖糖的2'-羟基。这种替代品包括2'-O-甲基,2'-O-甲氧基乙基和2'-氟改性。作为额外的益处,这些修饰也影响核糖糖的构象由于它们的吸电子性能,这是可以增加siRNA双链体的结合亲和力的效果。[4]桥接呋喃糖环的2'和4'位置 - 称为锁定的核酸 - 表现出类似的对siRNA结合亲和力的影响。然而,掺入太多这样的修饰可以在RISC载荷期间抑制siRNA双链体的解离。[4]

总体而言,糖修改比骨干修饰更常见,因为它们不会影响RISC的siRNA识别。[8]

4.基础修改

免疫细胞可以将外部RNA与“自我”RNA区分开,因为前者缺乏在哺乳动物细胞中自然发生的化学修饰。这些包括糖改性(图1中的彩色品红色),例如2'-O-甲基和基础取代,其改性碱如假尿苷,5'-甲基胞苷,N6-甲基腺苷,杀虫碱和N7-甲基胍芹。因此,在这些位点进行修饰siRNA将使它们允许逃避免疫检测[9],但也可以降低它们的沉默效力。[10]

5.脂质共轭

不太常见于其他修饰,脂质可以与siRNA的5'或3'末端缀合,以改善它们体内通过允许它们与血清脂蛋白联系起来的生物利用度。例如,胆固醇和维生素E缀合物在静脉内注射时显着增强肝脏和其他组织中的siRNA吸收。[4]其他脂肪酸 - 即,棕榈酸盐和生育酚 - 在保持基因沉默活性的同时证明小鼠的毒性较小。[11]

我应该使用修改后的sirnas吗?

虽然不需要许多人体外应用,化学修饰的siRNA通常比其未修改的对应物更好。在我的经验中,有效降低了化学改性siRNA的增强稳定性,从而减少了获得足够基因敲低所需的siRNA的浓度。这是重要的,因为高浓度的siRNA可以导致偏离目标效应[12](一般而言,您应该只使用尽可能多的siRNA以充分沉默您的目标)。最多体内另一方面,应用程序由于与之相关的挑战,绝对需要化学修改的SIRNA体内RNAi(例如,生物利用度和蜂窝摄取)。

谢天谢地,许多商业供应商 -Thermofish.IDT.Millipore-Sigma., 和地平线发现若有一些 - 通过为稳定性和效力提供化学修改的SIRNA来获取siRNA优化的猜测。您可以综合您自己的修改的siRNA,但请记住,这可能需要在过程的每一步中进行大量优化。

无论您是商业上的SIRNA吗?如何自己,都必须平衡化学修饰,以免降低基因沉默效力 - 毕竟,如果它可以沉默其预期的目标,高度稳定的siRNA只是良好的。

参考

  1. 一个胜利的毅力过度干扰。NAT BIOTECHNOL。2018; 36(9):775。
  2. Weitzer S,人RNA激酶HClP1在3'转移RNA外显子和短暂干扰RNA上活跃。自然。2007; 447(7141):222-6。
  3. Haraszti ra,5-乙烯基膦酸盐改善了体内共轭SiRNA的组织积累和功效。核酸RES。2017; 45(13):7581-92。
  4. Lennox Ka,RNA干扰和CRISPR / CAS基因组编辑试剂中的化学修饰。方法Mol Biol。2020; 2115:23-55。
  5. 延泰H,用高亲和力对高迁移率组箱蛋白(HMGBS)的非亲和力的非免疫寡聚寡核苷酸免疫应答。Proc Natl Acad Sci U S A. 2011; 108(28):11542-7。
  6. Meade Br,高效递送含有可逆电荷中和磷酸二酯骨架修饰的RNAi前药。NAT BIOTECHNOL。2014; 32(12):1256-61。
  7. 哈米尔一样,小干扰核糖核核性谱系的合成与缀合。方法Mol Biol。2016; 1364:1-9。
  8. Chiu YL,RNAi中的siRNA功能:化学修饰分析。RNA。2003; 9(9):1034-48。
  9. Kariko K,通过Toll样受体抑制RNA识别:核苷改性的影响和RNA的进化起源。免疫。2005; 23(2):165-75。
  10. Sipa K,基础修饰对短干扰RNA结构,热力学稳定性和基因沉默活性的影响。RNA。2007; 13(8):1301-16。
  11. Ostergaard Me,疏水性部分的缀合可增强反义寡核苷酸在啮齿动物和非人的肌肉中的效力。核酸RES。2019; 47(12):6045-58。
  12. 咖啡博士,可以在与个人效力匹配的浓度下减少siRNA脱靶效果。Plos一个。2011; 6(7):E21503。
五个修理官工作表示五种修改

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