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用Crispr升级你的药物筛查

内容赞助Sigma-Aldrich®先进的基因组学

微孔板的图像用于表明CRISPR如何扩展到进行CRISPR筛选。

信号传导途径对于适当的细胞功能至关重要,从控制细胞增殖以触发必要的细胞死亡。信号传导中的错误在许多疾病中起重要作用,包括癌症和遗传疾病,并且可以是有用的药物靶标。然而,鉴定这些潜在的药物靶标具有挑战性,因为信号通路是复杂的并且涉及血液蛋白质和分子。

Crispr筛选

在过去的几年里,Crispr(集群,定期间隙,短文重复)筛查方法已成为药物发现工具包的成功添加。[1] CRISPR相关的蛋白质9(CAS9)是一种良好的系统,其使用指导RNA(GRNA)以靶向方式操纵单个基因。

通过创建GRNA库进行缩放CRISPR方法使大型基因组屏幕能够提供所涉及特定途径的所有基因的概述。[2]在全基因组水平下,可以进行CRISPR丧失功能(LOF)和功能增益(GOF)屏幕。[3]最终,这可以允许对新药靶标的无偏见鉴定。[1]可以通过两种方式实现LOF屏幕:

  1. 传统Crispr淘汰(KO),其中直接编辑目标基因以防止功能性基因产物的表达。
  2. CRISPR干扰(CRISPRi),即通过阻止转录机制表达基因来抑制靶基因的转录。这种方法利用了催化活性不高的Cas9,不发生基因编辑。

Crispr Ko屏幕比RNA干扰(RNAi)屏幕更有效,确保完全基因敲低。此外,CRISPR KO屏幕可能导致比RNAi屏幕更少的偏离目标效果。[4] RNAi对mRNA水平进行基因表达,而CRISPR干扰(克里普利)和CRISPR激活(Crispra.)主要在转录水平调控基因表达。这使得使用CRISPRi和CRISPRa靶向非编码区域成为可能。

CRISPR筛选的一般考虑因素

在规划CRISPR屏幕时,有五个主要方面需要考虑,如图1所示。在筛选前正在考虑的这些方面可以帮助确定最合适的文库,格式和整体方法。

用Crispr升级你的药物筛查

图1所示。CRISPR筛选的一般考虑因素

1.试剂和物资

在规划CRISPR筛选时,首先要考虑的是进行筛选所需的材料。试剂和细胞模型的可用性、成本和可伸缩性可能影响屏幕的设计。例如,如果使用原代细胞,筛选所需的大量细胞可能是不可行的,在这种情况下,具有高增殖水平的细胞系可能是可取的。考虑成本和试剂的可用性是必要的,因为这可能影响屏幕的范围。如果试剂丰富,全基因组筛选可能是可行的,但如果试剂是一个限制因素,一个更小,更有针对性的筛选可能更经济。

2.稳定的细胞系生产

许多CRISPR筛选工作流程的第一步涉及表达CAS9核酸酶的细胞的产生和分离。该步骤可以在根据所选择的细胞系上产生的时间和过程中变化,并且是否使用瞬态或稳定转染。Cas9的稳定表达确保核酸酶在筛选中的所有细胞上一致。然而,生成Cas9线比使用瞬态表达式更耗时。对于瞬态和稳定的转染,成功表达CAS9的细胞的分离可以通过抗生素选择或荧光激活的细胞分选(FACS)来进行,这取决于抗生素抗性基因或荧光团是否存在于表达载体中。

3.药物选择

为屏幕选择的药物的作用机制决定了所需的筛选时间以及对筛选的表型决定。如下所述,表型将影响筛选平台的选择。

富集/表型

应考虑到测量的表型,并应根据小规模初步实验的结果确定明确的预期结果。混合筛选将需要检测允许富集的表型,如细胞增殖或基于报告的分析的激活。[2]

5.NGS和反褶积(用于合并屏幕)

在规划合并筛选时,需要额外的测序和反褶积步骤来确定阳性结果,这需要访问测序设施和生物信息学支持。另外,西格玛奥尔德里奇®Deconvolution服务是一种具有成本效益的方法来识别来自汇集CRISPR屏幕的必要基因。

主要工作流概述

在分离表达CAS9的细胞后,然后在用感兴趣的化合物刺激之前用GRNA文库转染细胞。屏幕完成后,分析数据,并验证任何潜在的命中。

CRISPR屏幕的具体步骤取决于使用的是池库还是阵列库(图2)。

用Crispr升级你的药物筛查

图2.使用CRISPR / CAS9绘制池与阵列方法的常规工作流程。©2015年Agrotis和Ketterer [5],在CC下许可的4.0。MOI,多种感染;SGRNA,单引导RNA。

汇集图书馆屏幕

一个聚合库可以在同一根试管中包含数千种grna,这些grna可以同时被输送到单个试管中生长的细胞中。这一步骤需要永久整合(例如,通过慢病毒转导)到细胞基因组中,以确保gRNAs的持久性,这些gRNAs随后被放大,以识别反卷积过程中的阳性打击。[2]

例如GeCKO或Sigma全基因组库为全基因组Crypr屏幕提供成本效益和直接的方法,都是体外体内。然而,随着筛选发生在一个单一的细胞中,将表型与基因改变的链接更复杂。通过基因设定富集收集阳性命中,这限制了评估的表型(例如,增殖或报告基因的表达)。[7,8]在富集之后,需要一种去卷积步骤来识别额外的阳性点击,这使得与阵列的屏幕相比,分析步骤更加复杂。

排列图书馆屏幕

在阵列文库中,细胞在多孔板中生长。通过对单个或多个GRNA的转染仅通过转染仅靶向一个基因。在屏幕之后,每个井的表型评估单独提供一种识别命中的简单方法。该方法还允许通过高含量成像或细胞表型读出各种复杂的表型读出。然而,阵列方法需要访问可以处理涵盖所有感兴趣目标所需的大量板材的自动化设备。利用这种方法,筛选时间也直接依赖于克隆的数量,使阵列库屏幕更加可行的用于询问基因的子集而不是对整个基因组的分析。

后屏幕考虑

在后筛选过程中需要注意的事项不仅包括命中识别的机制,还包括随后的验证步骤。当使用混合筛选时,应使用附加的gRNAs对已识别的靶标进行重新分析,并通过分析蛋白表达和详细的表型特征进一步验证。[7]

CRISPR筛选格式

CRISPR筛选可以以多种格式进行,其中许多格式可以用于筛选应用。常见的CRISPR格式包括CRISPR敲除(KOs)、CRISPR敲除(knockouts)、CRISPR激活(CRISPRa)和CRISPR干扰(CRISPRi)。

CRISPR KO屏幕

在CRISPR KO屏幕中,CAS9在GRNA指定的位置引入了双轴断裂。当内源性非同源终端连接(NHEJ)DNA修复系统校正这些突破时,这通常导致引入有效敲出基因的框架移位突变。[2]

西格玛奥尔德里奇®产品包括慢病毒载体为基础的CRISPR全基因组KO库阵列格式,如Sanger全基因组图书馆,[9]或作为汇集的库,如壁虎和西格玛池。

CRISPR敲击屏幕

CRISPR敲击实验,涉及将序列插入靶基因,可用于引入单一核苷酸多态性,转基因,标签或荧光报告者。然而,实现了Crisprpl-In比KO更具挑战,因为它涉及为CRISPR机械提供供体DNA模板。因此,该方法目前不容易扩展超出单一基因靶标。

Crispra和Crispri屏幕

CRISPRi和CRISPRa都是可扩展的,可以通过转录抑制和转录激活来筛选基因。这些系统使用Cas9的核酸酶缺陷版本(DCAS9.),它仍然可以结合和招募更多的结构域到gRNA靶位点,但不能切断靶DNA。[3, 11]在CRISPRi中,dCas9与一个转录抑制因子融合,如KRAB,而CRISPRa需要转录激活因子,包括VP64。[11]

最有效的Crispra系统使用CRISPR协同激活介质(SAM)复合体.该系统使用DCAS9-VP64复合物,其中两个额外的转录激活活化剂与GRNA一起引入细胞中。[11,12,13]

协同使用屏幕

利用多种筛选格式提供互补的见解进入相同的途径。[3,10]一个公开的例子显示了一个好处在研究癌症中的CRISPR.在这个例子中,使用CRISPRa的肿瘤生长筛选识别了K562细胞的肿瘤抑制因子,而同一系统中的LOF CRISPRi筛选检测了必要的管家基因。[3]同样,CRISPRa通过CRISPRi毒性筛选提供了关于毒性途径的额外信息。CRISPRa和CRISPRi的联合使用确定了使K562细胞对蓖麻毒素敏感和脱敏的两个基因。[3]

图书馆选择

为CRISPR毒品屏幕选择合适的库可能是挑战性的。西格玛奥尔德里奇®CRISPR产品提供了一系列选择,使选择合适的文库变得更容易。通过与桑格研究所的合作,Sigma-Aldrich®CRISPR筛查产品包括一个全基因组排列的CRISPR KO文库和排列的库板可以以质粒或慢病毒格式递送。用于汇集屏幕,壁虎或Sigma全基因组池,人类激酶池和定制CRISPL面板是可用的。单细胞分析也可以用10x基因组学兼容CRISPR池。

CRISPR药物筛选

CRISPR筛选使用带有gRNA文库的CRISPR- cas9系统一次调节多个基因的表达。CRISPR允许LOF (CRISPR KO或CRISPRi)和GOF屏幕(CRISPRa)。CRISPRi和CRISPRa都使用融合在转录抑制因子或激活因子上的dCas9。

LOF和GOF筛选的联合使用使识别所研究通路的抑制和激活成分成为可能,允许识别介导药物下游效应或对某些药物具有耐药性的基因。这种联合协同的方法有利于进一步研究的潜在新目标的识别。

CRISPR屏幕可作为排列或汇集屏幕使用。阵列屏幕,虽然资源密集型前沿,更简单地分析,并可以监控复杂的表型。汇总屏幕更具成本效益,更简单地进行实验,但可以仅评估一小范围的表型,并且下游数据分析可以复杂,因为需要碎屑。

西格玛奥尔德里奇®CRISPR筛选产品包括各种汇集和阵列CRISPR文库,涵盖全基因组或基因面板,并提供LOF或GOF屏幕。其他服务和支持对于您希望了解更多关于哪些筛选工具对其研究需求最有用的研究人员可以使用。

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参考文献

  1. Fellmann, C。Crispr-Cas的基石在药物发现和治疗中.NAT Rev Disp Discov。(2017)16,89-100。DOI:10.1038 / nrd.2016.238
  2. DOEAM,J。G.我准备好了Crispr吗?遗传屏幕的用户指南.Nat Rev gen(2018) 19,67 - 80。DOI: 10.1038 / nrg.2017.97
  3. Gilbert,L. A.,基因组规模的crispr介导的基因抑制和激活控制.细胞。159年(2014),647 - 661。DOI: 10.1016 / j.cell.2014.09.029
  4. 史密斯,我,通过连接图中大规模基因表达分析评估RNAI和CRISPR技术.PLOS Bio. 15, e2003213(2017)。DOI: 10.1371 / journal.pbio.2003213
  5. Agrotis,A.,在阵列库筛选中使用CRISPR / CAS9功能基因组学的新时代.前群体。(2015)6。DOI:10.3389 / FGENE.2015.00300
  6. 陈,斯。,全基因组CRISPR筛选小鼠肿瘤生长和转移模型.细胞。160年(2015),1246 - 1260。DOI: 10.1016 / j.cell.2015.02.038
  7. 里程,L. A.,体外聚合CRISPR/Cas9筛选的设计、执行和分析.2016年2月283,3170-3180。DOI: 10.1111 / febs.13770
  8. 杨,J.,基因组规模CRISPRa筛选识别细胞重编程的新因素.干细胞的报道。(2019) 757 - 771。DOI: 10.1016 / j.stemcr.2019.02.010 #
  9. Metzakopian、E。增强基因组编辑工具箱:基因组宽CRISPR阵列库.SCI REP。(2017)7,1-9。DOI:10.1038 / S41598-017-01766-5
  10. Horlbeck, m·A。紧凑且高活跃的下一代文库,用于CRISPR介导的基因抑制和激活.eLife。(2016) 5, e19760。DOI: 10.7554 / eLife.19760
  11. Konermann、S。由工程式CRISPR-CAS9复合物的基因组规模转录激活.大自然。517年(2015),583 - 588。DOI: 10.1038 / nature14136
  12. 查韦斯、。Cas9激活剂在多种物种中的比较.NAT方法。(2016)13,563-567。DOI:10.1038 / nmeth.3871
  13. Tragante v,等等。基因集合富集分析:从心力衰竭表型中吸取的教训.BioData Min.(2017) 10:18。DOI: 10.1186 / s13040 - 017 - 0137 - 5
微孔板的图像用于表明CRISPR如何扩展到进行CRISPR筛选。
图片来源:Caleb Foster

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