跳到内容

用Crispr升级你的药物筛查

内容赞助Sigma-Aldrich®高级基因组学

微孔板的图像用于表明CRISPR如何扩展到进行CRISPR筛选。

信号传导途径对于适当的细胞功能至关重要,从控制细胞增殖以触发必要的细胞死亡。信号传导中的错误在许多疾病中起重要作用,包括癌症和遗传疾病,并且可以是有用的药物靶标。然而,鉴定这些潜在的药物靶标具有挑战性,因为信号通路是复杂的并且涉及血液蛋白质和分子。

Crispr筛选

在过去的几年里,Crispr(集群,定期间隙,短文重复)筛查方法已成为药物发现工具包的成功添加。[1] CRISPR相关的蛋白质9(CAS9)是一种良好的系统,其使用指导RNA(GRNA)以靶向方式操纵单个基因。

通过创建GRNA库进行缩放CRISPR方法使大型基因组屏幕能够提供所涉及特定途径的所有基因的概述。[2]在全基因组水平下,可以进行CRISPR丧失功能(LOF)和功能增益(GOF)屏幕。[3]最终,这可以允许对新药靶标的无偏见鉴定。[1]可以通过两种方式实现LOF屏幕:

  1. 传统Crispr淘汰(KO),其中直接编辑目标基因以防止功能性基因产物的表达。
  2. 通过防止转录机制表达基因来抑制靶基因的转录,抑制靶基因的干扰(Crispri)。该方法利用催化活性CAS9并且不会发生基因编辑。

Crispr Ko屏幕比RNA干扰(RNAi)屏幕更有效,确保完全基因敲低。此外,CRISPR KO屏幕可能导致比RNAi屏幕更少的偏离目标效果。[4] RNAi对mRNA水平进行基因表达,而CRISPRI和CRISPR激活(Crispra.)主要在转录水平上调节基因表达。这使得可以使用CRISPRI和CRISPRA来靶向非编码区域。

CRISPR筛选的一般考虑因素

在规划CRISPR屏幕时,有五个主要方面需要考虑,如图1所示。在筛选前正在考虑的这些方面可以帮助确定最合适的文库,格式和整体方法。

用Crispr升级你的药物筛查

图1. CRISPR筛选的一般注意事项

1.试剂和用品

计划CRISPR屏幕时的第一次考虑涉及进行屏幕所需的材料。试剂和蜂窝模型的可用性,成本和可扩展性可能会影响屏幕的设计。例如,如果使用主细胞,则筛选所需的大量细胞可能是不可行的,在这种情况下,可以优选具有高水平增殖的细胞系。考虑到试剂的成本和可用性至关重要,因为这可能会影响屏幕的范围。如果试剂丰富,则全基因组筛网可能是合理的,而如果试剂是限制因子,则较小,更靶向屏幕可能更具成本效益。

2.稳定的细胞系生产

许多CRISPR筛选工作流程的第一步涉及表达CAS9核酸酶的细胞的产生和分离。该步骤可以在根据所选择的细胞系上产生的时间和过程中变化,并且是否使用瞬态或稳定转染。Cas9的稳定表达确保核酸酶在筛选中的所有细胞上一致。然而,生成Cas9线比使用瞬态表达式更耗时。对于瞬态和稳定的转染,成功表达CAS9的细胞的分离可以通过抗生素选择或荧光激活的细胞分选(FACS)来进行,这取决于抗生素抗性基因或荧光团是否存在于表达载体中。

3.药物选择

为屏幕选择的药物的作用机制决定了所需的筛选时间以及对筛选的表型决定。如下所述,表型将影响筛选平台的选择。

富集/表型

应考虑测量的表型,并应根据小规模初步实验的结果来确定对结果的明确期望。汇集屏幕将需要检测允许富集的表型,例如细胞增殖或基于报告的测定的激活。[2]

5. NGS和Deconvolution(用于汇集屏幕)

当规划汇集屏幕时,需要额外的测序和解卷积步骤来识别阳性点击,这需要访问测序设施和生物信息学支持。或者,西格玛奥尔德里奇®Deconvolution服务是一种具有成本效益的方法来识别来自汇集CRISPR屏幕的必要基因。

主要工作流程概述

在分离表达CAS9的细胞后,然后在用感兴趣的化合物刺激之前用GRNA文库转染细胞。屏幕完成后,分析数据,并验证任何潜在的命中。

CRISPR屏幕的具体步骤根据使用池或阵列的库是否有所不同(图2)。

用Crispr升级你的药物筛查

图2.使用CRISPR / CAS9绘制池与阵列方法的常规工作流程。©2015年Agrotis和Ketterer [5],在CC下许可的4.0。MOI,多种感染;SGRNA,单引导RNA。

汇集图书馆屏幕

汇集的库可以在同一管中包含成千上万的GRNA,它们都同时递送至在单个血管中生长的细胞。该步骤需要永久整合(例如,通过慢病毒转导)进入细胞基因组,以确保稍后被扩增的GRNA的持续性以在去卷积期间识别阳性击球。[2]

汇集图书馆如壁虎或Sigma全基因组池为全基因组Crypr屏幕提供成本效益和直接的方法,都是体外体内。然而,随着筛选发生在一个单一的细胞中,将表型与基因改变的链接更复杂。通过基因设定富集收集阳性命中,这限制了评估的表型(例如,增殖或报告基因的表达)。[7,8]在富集之后,需要一种去卷积步骤来识别额外的阳性点击,这使得与阵列的屏幕相比,分析步骤更加复杂。

排列的库屏幕

在阵列文库中,细胞在多孔板中生长。通过对单个或多个GRNA的转染仅通过转染仅靶向一个基因。在屏幕之后,每个井的表型评估单独提供一种识别命中的简单方法。该方法还允许通过高含量成像或细胞表型读出各种复杂的表型读出。然而,阵列方法需要访问可以处理涵盖所有感兴趣目标所需的大量板材的自动化设备。利用这种方法,筛选时间也直接依赖于克隆的数量,使阵列库屏幕更加可行的用于询问基因的子集而不是对整个基因组的分析。

后屏幕考虑

要记住后筛选过程的一些考虑因素不仅包括点击识别的机制,而且包括后续验证步骤。使用池筛时,应使用额外的GRNA对鉴定的靶标进行反射阳性点击,并通过分析蛋白质表达进一步验证并进行详细表征表型。[7]

CRISPR筛选格式

CRISPR筛选可以以各种格式进行,其中许多是可用于缩放用于筛选应用的缩放。常见的CRISPR格式包括CRISPR淘汰(KOS),CRISPR敲击,CRISPR激活(CRISPRA)和CRISPR干扰(CRISPRI)。

CRISPR KO屏幕

在CRISPR KO屏幕中,CAS9在GRNA指定的位置引入了双轴断裂。当内源性非同源终端连接(NHEJ)DNA修复系统校正这些突破时,这通常导致引入有效敲出基因的框架移位突变。[2]

西格玛奥尔德里奇®产品包括慢病毒矢量的CrisprupRul全基因组KO图书馆作为阵列格式,如Sanger全基因组图书馆,[9]或作为汇集的库,如壁虎和西格玛池

CRISPR敲击屏幕

CRISPR敲击实验,涉及将序列插入靶基因,可用于引入单一核苷酸多态性,转基因,标签或荧光报告者。然而,实现了Crisprpl-In比KO更具挑战,因为它涉及为CRISPR机械提供供体DNA模板。因此,该方法目前不容易扩展超出单一基因靶标。

Crispra和Crispri屏幕

克里普利或CRISPRA都是可扩展的,并通过抑制和转录激活来筛选基因。[10]这些系统使用CAS9的核酸酶缺陷版本(DCAS9.),它仍然可以将额外的结构域诱导并募集到GRNA靶位,但不能切割目标DNA。[3,11]在CRISPRI中,DCAS9与转录抑制器(例如Krab)融合,而CRISPRA需要转录活化剂,包括VP64。[11]

最有效的Crispra系统使用CRISPR协同激活介质(SAM)复合体。该系统使用DCAS9-VP64复合物,其中两个额外的转录激活活化剂与GRNA一起引入细胞中。[11,12,13]

协同使用屏幕

利用多种筛选格式提供互补的见解进入相同的途径。[3,10]一个公开的例子显示了一个好处在研究癌症中的CRISPR。在该实施例中,使用CrisPRA鉴定K562细胞的肿瘤抑制剂的肿瘤生长筛,而同一系统中的LOF CRIPRI屏幕检测到基本的内政基因。[3]同样,Carrpra在互补毒性筛选时提供有关毒性途径的其他信息。Crispra和Crispri的结合使用鉴定了敏化和敏化K562细胞对蓖麻素治疗的基因。[3]

图书馆选择

为CRISPR毒品屏幕选择合适的库可能是挑战性的。西格玛奥尔德里奇®CRISPR产品可以通过提供一系列选择来更轻松地选择合适的库。通过与Sanger Institute,Sigma-Aldrich合作®CRISPR筛查产品包括一个全基因组排列库,用于CRISPR KO和排列的库板可以以质粒或慢病毒格式递送。用于汇集屏幕,壁虎或Sigma全基因组池,人类激酶池和定制CRISPL面板可用。单细胞分析也是可能的10x基因组学兼容CRISPR池

Crispr药物筛选总结

CRISPR筛选使用CRISPR-CAS9系统与GRNA文库一次调节许多基因的表达。CRISPR允许LOF(CRISPR KO或CRISPRI)和GOF屏幕(CROFPRA)。CRISPRI和CRISPRA都使用DCAS9与转录压缩机或活化剂融合。

LOF和GOF屏幕的结合使用使得可以识别所研究的途径的压抑和激活组分,从而允许鉴定介导药物或特征耐药于某些药物的下游效果的基因。这种综合协同方法有助于确定进一步调查的潜在新目标。

CRISPR屏幕可作为排列或汇集屏幕使用。阵列屏幕,虽然资源密集型前沿,更简单地分析,并可以监控复杂的表型。汇总屏幕更具成本效益,更简单地进行实验,但可以仅评估一小范围的表型,并且下游数据分析可以复杂,因为需要碎屑。

西格玛奥尔德里奇®CRISPR筛选产品包括各种汇集和阵列CRISPR文库,涵盖全基因组或基因面板,并提供LOF或GOF屏幕。附加服务和支持对于您希望了解更多关于哪些筛选工具对其研究需求最有用的研究人员可以使用。

更多CrisPr的资源

CRISPR文章

CRISPR网络研讨会

CRISPREBEB.

CRISPR基因编辑101

CRISPR工具

而且你还应该考虑以下西格玛 - aldrich®资源:

发现更多关于Crispr的信息bob体育是赌钱的吗BiteSize Bio Crisp Research Hub

参考

  1. Fellmann,C.,Crispr-Cas的基石在药物发现和治疗中。NAT Rev Disp Discov。(2017)16,89-100。DOI:10.1038 / nrd.2016.238
  2. DOEAM,J。G.我准备好了Crispr吗?遗传屏幕的用户指南。NAT Rev Gen.(2018)19,67-80。DOI:10.1038 / NRG.2017.97
  3. Gilbert,L. A.,基因组规模克切普尔介导的基因抑制和活化控制。细胞。(2014)159,647-661。DOI:10.1016 / J.Cell.2014.09.029
  4. 史密斯,我,通过连接图中大规模基因表达分析评估RNAI和CRISPR技术。Plos Bio。15,E2003213(2017)。DOI:10.1371 / journal.pbio.2003213
  5. Agrotis,A.,在阵列库筛选中使用CRISPR / CAS9功能基因组学的新时代。前群体。(2015)6。DOI:10.3389 / FGENE.2015.00300
  6. 陈,斯。,基因组 - 宽的肿瘤生长和转移的小鼠模型中的Crispr屏幕。细胞。(2015)160,1246-1260。DOI:10.1016 / J.Cell.2015.02.038
  7. 里程,L. A.,在体外CRISPR / CAS9屏幕汇集的设计,执行和分析。FEBS J.(2016)283,3170-3180。DOI:10.1111 / FEBS.13770
  8. 杨,J.,基因组规模Crispra筛网识别细胞重编程的新因素。干细胞报告。(2019)12,757-771。DOI:10.1016 / J.Stemcr.2019.02.010#
  9. Metzakopian,E.,增强基因组编辑工具箱:基因组宽CRISPR阵列库。SCI REP。(2017)7,1-9。DOI:10.1038 / s41598-017-01766-5
  10. Horlbeck,M. A.,紧凑且高活跃的下一代文库,用于CRISPR介导的基因抑制和激活。Elife。(2016)5,E19760。DOI:10.7554 / ELIFE.19760
  11. Konermann,S。,由工程式CRISPR-CAS9复合物的基因组规模转录激活。自然。(2015)517,583-588。DOI:10.1038 / Nature14136
  12. 查韦斯,A.,Cas9激活剂在多种物种中的比较。NAT方法。(2016)13,563-567。DOI:10.1038 / nmeth.3871
  13. Tragante v,等等。基因集浓缩分析:从心力衰竭表型中学到的经验教训。Biodata min。(2017)10:18。DOI:10.1186 / s13040-017-0137-5
微孔板的图像用于表明CRISPR如何扩展到进行CRISPR筛选。
图像信用:Caleb Foster

发表评论

你一定是登录发表评论。

本网站使用AkisMet减少垃圾邮件。了解如何处理评论数据

滚动到顶部
分享Via
复制链接