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选择压力:分子克隆中抗生素的替代品

一只手选择用鲜花的木图,表示分子克隆的选择

抗生素用于分子生物学中作为在克隆时保持选择性压力的方法。你将插入插入含有氨苄青霉素抗性基因的质粒,使用该构造来改变你的大肠杆菌,然后培养含氨苄青霉素的培养基。大部分地生长的细菌患了克隆基因。相当有效和直截了当,但有没有缺点?

对抗生素抗性的担忧

社区和医疗保健环境中的抗生素抗性已成为一个重要的问题,临床医生和兽医在医学和农业中采用更好的抗生素管理实践,以减少抗生素抗性生物的传播。

分子生物学实验室中使用抗生素是否有助于实验室以外的抗生素抗性?研究界的一些人提出了担忧,[1]虽然需要更多的数据来确定这一点,但在那里有更多数据来接触研究人员和水平抗性基因转移。如果将培养的生物将被加工以制造,例如疫苗,则尤其如此。所以,如果这令你担心你,恐惧不是,有抗生素选择的替代方案 - 让我们看看下面的一些人!

选择的替代方法

有两种主要方法,可以选择所需的克隆。人们利用天然存在的系统,其维持一些存在的F质粒大肠杆菌,另一个采用必须在富含培养基上培养的突变菌株存活。这些总结在图1中。

选择压力:分子克隆中抗生素的替代品

图1。
A,空向量产生毒素。用空载体转化的细胞不可行。
B,用重组载体转化的细胞是可行的。
C,在最小培养基上培养时,缺乏临界代谢基因的修饰菌株不会存活。
D,在最小培养基上培养时,重组载体保持在宿主菌株中。

后杀菌杀戮

抗生素选择的一种替代方案是杀菌后杀戮(PSK)系统。这里连续产生相对不稳定的抗毒素以抑制更稳定的毒素杀死细胞。普通的PSK系统由CCD操纵子编码,该CCD操纵子通常位于存在于的F因子质粒上大肠杆菌。[2]

毒素编码基因,CCDB.,产生一种蛋白质,使DNA戊曲酶与双链DNA的碎裂杀死宿主细胞。CCD操纵子中的另一个基因称为CCDA,产生用作CCDB毒素的解毒剂的抗毒素,并允许宿主细胞存活。如果你失去了CCDA基因,不再产生抗毒素,并且细胞屈服于CCDB。[2]

Delphi遗传学也开发了一个CCDB.系统称为staby®专门设计用于消除抗生素选择。[3]这个系统置于CCDA网上的基因和CCDB.宿主染色体上的基因。只有窝藏的细胞CCDA- 统一的质粒将存活。

对CCD PSK系统的扭曲是放置CCDB.多胶位位点内的基因内框架(MCS)。[4,5]将您的插入连接到MCS中扰乱了CCDB.基因并允许转化细胞存活。用重连接的空载体转化的细胞会表达CCDB.基因和随后死亡。

营养养殖互补

另一种方法使用营养营养互补(AC)。AC使用具有临界基因的细菌菌株,导致必需代谢途径的破坏。在缺乏关键营养素的最小培养基上培养时,生物体无法存活。

一个大肠杆菌缺乏喹啉酸磷酰基转移酶(QAPrtase)基因的菌株是AC系统的一个很好的例子。这大肠杆菌应变对此有缺陷德诺维除非存在QaPrtase基因,否则NAD的合成并不能在最小培养基上生长。交换来自PUC19的基因(氨苄青霉素抗性)与QAPrtase基因导致载体可以改变缺陷的载体大肠杆菌在培养最小培养基时,应变并保持质粒而无需抗生素。Qaprtase是中核和真核生物中NAD途径中的常见酶,所以如果您使用的是DNA疫苗的载体让我们说,您可以选择QAPRTase的人类版本,而不是担心外源基因的水平转移。[6]

还基于其他关键基因的其他缺失开发了其他营养性辅助互补系统,包括:

  • glna.(谷氨酸合成酶)[7]
  • Thya.(胸苷酸合成酶)[8]
  • asd.(天冬氨酸β-半醛脱氢酶)。[9]

就像缺失QAPrtase一样,这些基因的缺失会破坏在最小培养基上培养时使不活性生物的代谢途径破坏了代谢途径。

虽然这些例子确实避免使用抗生素,但有一些挑战:您必须拥有或创建专门的菌株(通常是删除突变体)和媒体,以使这些系统工作,但努力得到贡献。

希望,如果您考虑尝试抗生素选择的替代品,这些例子会对您有所帮助。如果您已经离开了抗生素,请不要害羞并分享您在评论中的任何提示!

参考

  1. Bowater L.抗微生物管道:科学家的作用?J antimicrob Chemother。(2015);70(7):1925-1927。DOI:10.1093 / JAC / DKV071
  2. ogura t和希拉戈斯。将宿主细胞分裂耦合到质粒增殖的迷你F质粒基因pnas.。(1983);80(15):4784-4788。DOI:10.1073 / PNAS.80.15.4784
  3. staby®系统。德尔福遗传学技术。访问2020年6月27日。
  4. 伯纳德P,使用F质粒CCDB杀伤基因的阳性选择载体基因。1994年; 148(1):71-74。DOI:10.1016 / 0378-1119(94)90235-6
  5. 伯纳德,P.CCDB重组DNA的阳性选择。?生物技术。1996年; 21(2):320-323。DOI:10.2144 / 96212PF01
  6. 福斯特JW和Moat AG。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸生物合成和微生物系统中的吡啶核苷酸循环代谢Microbiol Rev.。1980; 44(1):83-105。
  7. ryan等,振动疫苗载体血管疫苗载体αGlig抗原表达ΔGlNA平衡致死质粒体系的研制感染IMUN。2000; 68(1):221-226。DOI:10.1128 / IAI.68.1.221-226.2000
  8. 莫罗娜r,基于大肠杆菌Coli +基因的非抗生素选择系统构建质粒载体:霍乱疫苗发育的应用。基因。1991; 107(1):139-144。DOI:10.1016 / 0378-1119(91)90307-W
  9. Curtiss R,重组无毒沙门氏菌疫苗菌株,体内克隆基因的稳定维护和高水平表达。免疫素投资。1989; 18(1-4):583-596。DOI:10.3109 / 08820138909112265
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