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准备中期扩散:分解细胞上的分解

卡通染色体在单色背景上展开,在focus描绘准备中期传播的单个染色体图像

细胞遗传学是赋予染色体研究的遗传学的分支。基因组中的染色体不稳定性和染色体重排用于诊断和定义几种遗传疾病,甚至一些癌症。[1,2]研究人员使用各种技术来识别染色体的结构,包括荧光原位杂交(鱼),核型化,流式细胞术和对比基因组杂交(CGH)。

即使你不是一个细胞遗传学家,你可能需要评估染色体的不稳定性在一个特定的细胞系,例如,在你使用他们在你的论文项目(特别是如果你使用胚胎干细胞)。(3、4)

评估染色体不稳定性或染色体重排的第一步是收集染色体,这本身就是一种艺术形式。

准备中期蔓延的第一步

首先,在收获之前,您的细胞需要大约80%的融合(和健康!)。如果您没有足够的细胞,则可能不会最终有足够的染色体进行进一步分析。

逮捕细胞周期

下一步是逮捕细胞周期。在中期中捕获细胞周期对于研究染色体至关重要,因为这是它们是最浓缩的点,允许更容易可视化。少数常见的中期抑制剂包括血氯化汀,脱盐素,长春碱和Nocodazole。[5,6]

地可霉素,或科尔西密,是最常用的化合物用来阻止细胞周期中期扩散。[7,8]秋水仙碱是一种合成的类似于秋水仙碱的剧毒物质。[9,10]长春碱和秋水仙碱一样,是一种存在于植物中的天然化合物,但也被证明会影响DNA合成,这很可能是它不被用于中期扩散的原因。(11、12)

这四种化合物都是通过破坏微管的稳定性来在中期阻滞细胞,从而阻止纺锤体组装并激活纺锤体组装检查点。[5,6]当细胞与这些化合物孵育时,细胞不能进入后期。

收获的时间

一旦你在中期捕获了你的细胞,就是开始收获的时候了!这几乎与收获细胞颗粒相同的方式,除了你将媒体与COLCEMID保留,而不是将其倒在一起。将Cocecemid-Spiked介质倒入锥形管中,然后促使您的细胞呈蛋白质化。一旦细胞脱离,用储存的COLCEMID掺入介质稀释胰蛋白酶。离心你的细胞,取出上清液,你将留下一种中期滞留细胞的颗粒。

第一个棘手的部分是:让细胞变得脆弱。对于中期扩散,我们需要打破细胞膜来帮助观察染色体。这些细胞必须非常脆弱,这样当它们掉到显微镜载玻片上时就会破裂。

要做到这一点,我们需要向细胞中加入低渗溶液,它的溶质浓度相对于细胞内部较低。这导致细胞内外形成渗透性梯度。因此,加入低渗溶液会导致细胞膨胀,使它们变得非常脆弱。把细胞想象成水球:你想让它们足够满,这样它们在碰到什么东西的时候就会破裂,但又不能满到在你手中折断!

达到这种平衡的最简单方法是每次加一点低渗溶液,而不是一次加全部。这样,你就可以慢慢地重新悬浮你的细胞,使其均匀膨胀。你要确保试管中没有细胞团。轻轻地轻敲管子应该可以打破任何不想要的细胞团块。中期扩散最常见的低渗溶液是氯化钾,但有些方案使用柠檬酸钠。(13 - 15)

抓住这个想法

一旦细胞与低渗溶液孵育,您想在这种肿胀状态下修复它们,以便存储以供将来使用。甲醇和乙酸的组合似乎是染色体收获的最常见的固定方法。单独使用甲醇,例如甲醇,将导致细胞收缩。加入与溶胀相关的乙酸,在其非肿胀状态下保留细胞。您可以将这些单元格存储为4°C的颗粒一年或直接进入下一步。[7]

准备的幻灯片

使中期染色体蔓延到幻灯片上是染色体收获的最困难的部分,并且有大量的辩论在最终传播中最有影响力。

一旦你准备好让你的中期扩散,重新悬浮你的细胞球在新鲜固定剂几次。这将有助于在你把细胞块放到幻灯片上之前清除它们。

诀窍是让重力为你做好工作,但你可能需要花一些时间优化距离。如果您的幻灯片和移液管之间的距离太大,您的染色体将分散得太远。当染色体分开太远时,可能难以确定它们是否来自一个细胞或两个细胞。如果您试图评估您的细胞的倍性,这可能是一个巨大的问题。[16]

如果您的幻灯片和移液管之间的距离太小,您的染色体将重叠并在一起。当你的染色体重叠时,你将无法分开。这将使您可能难以评估的任何染色。使用一次性转移移液管将您的细胞丢弃到清洁幻灯片上,但请记住,移液管的直径也可以影响滑块上的染色体。

湿度是中期扩散程序的关键组成部分,似乎是影响染色体如何在载玻片上传播的最重要因素。[17]固定剂从空气中拉出水分,这导致现在破碎的细胞的再水化。控制这种补液过程是美丽中期蔓延的关键!

保持滑动湿度的两个最常见的方法是:

  • 将细胞滴在玻片上之前,先用水湿润玻片(将玻片浸入水中或预冷冻),然后将玻片放在热板上晾干。
  • 使用干载玻片,滴下细胞,然后立即将载玻片放在有盖水浴的托盘上。

选择方法取决于个人,但整体信息是保持潮湿!

当干燥载玻片时,温度可以根据协议从20°C到75°C变化。[6、7、13、18、19]较高的温度会导致固色剂干燥过快。温度过低可能会导致幻灯片上的水分增加,因为冷空气不能像暖空气那样容纳那么多的水。这可能会导致你的定影剂干得太慢。因为干燥时间会影响染色体的传播,所以找到合适的温度和湿度组合来优化细胞的染色体传播是很重要的。[17]

关于制备中期蔓延的最终思想

一旦你的幻灯片干燥,染色体固定到位,它们就准备好了免疫染色等下游应用。在准备下一个幻灯片之前,它可能会有所帮助。这样,您可以基于在显微镜下看到的染色体展开来对您的方法(如距离,湿度和温度)进行任何调整。

最重要的是,请记住,完善您的中期蔓延是艺术!逐步逐步逐步是一个开始的好地方,但您需要优化您的需求的方法。如果您需要视觉协议或某些故障排除提示,请退房培养细胞染色体制备嘿嘿。[5]

您是否有故障排除染色体收获的提示?让我们在评论中知道。

参考:

  1. 王,N。”癌细胞源和分子细胞遗传学中的方法“,美国医学遗传学杂志Vol。115(3),P118-124,2002。
  2. Hochstenbach, R.等,"全基因组测序取代后核型蛋白划算时未检测到的临床相关染色体异常的调查,《欧洲医学遗传学杂志》第62卷第9期,103543,2019。
  3. Bolhaqueiro,A.等,“正在进行的染色体不稳定性和人结肠直肠癌有机体中的核型演变,《自然遗传学》2019年第51期,824-834页。
  4. Miura,M.等。,“脊髓骨髓间充质干细胞累积染色体不稳定性导致恶性转化《干细胞》vol.24(4), 1095-1103, 2006。
  5. Zulkipli,Ihsan N.等人,“药用植物:靶向细胞分裂的化合物的潜在来源。“药物目标见解Vol.9,9-19,2015年
  6. Moralli, D.等,"人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞染色体分析的改进技术干细胞评论和报告vol. 7, (2), 471-477, 2011
  7. Howe,B.等,“来自培养细胞的染色体制剂“可视化实验杂志。83,50203,2014。
  8. Schuck,P.L.等,“钓鱼损伤中期染色体“。Balakrishnan L.,Stewart J.(EDS)DNA修复。分子生物学的方法,VOL。1999年,2019年。
  9. Finkelstein,Yaron等,“血氯化汀中毒:古代药物的黑暗面《临床毒理学》vol. 48,5, 407-414, 2010。
  10. Rieder,C.等人,“Cocemid和有丝分裂循环“细胞科学,Vol。102,387-397,1992。
  11. Mhaidat,N.M.等。“长春新碱、长春碱和长春瑞滨对人培养淋巴细胞的遗传毒性的比较研究“BJMG Vol。19(1),13-20,2016。Doi:10.1515 / BJMG-2016-002
  12. 威廉姆斯,J.,Carpentieri,U.“胚胎中的中期逮捕化合物“。自然卷。216,613-614,1967。
  13. Michelland,S.等人,“一种可靠的高质量中期蔓延的方案,用于原位杂交“。技术提示在线Vol。3,126-127,1998。
  14. Kotsarenko,K。等,“核型在长期培养的蜱细胞系中变化“。SCI REP Vol.10,13443 .2020。
  15. utsumi,k。等,“染色体结构的研究I.低渗溶液处理所揭示的染色体展开:细胞结构和功能Vol。1975年1,93-99。
  16. Bakker,Bjorn等人。“如何计算细胞中的染色体:当前和新技术概述。“生物学:分子,细胞和发育生物学的新闻和评语。37,5,570-577,2015
  17. 邓,W.等,"一种改善中期染色体蔓延的新方法“cytometry,Vol。51A(1),46-51,2003。
  18. Purbeck,J.L.等人,“染色体蔓延的动态“。AM J MED GENET;卷。61(4),387-393,1996。DOI:10.1002 /(SICI)1096-8628(19960202)61:4 <387 :: AID-AJMG15> 3.0.co; 2 o。PMID:8834053。
  19. Henegariu等人,"细胞遗传学载玻片制剂的改进:控制染色体蔓延,化学老化和逐渐变性“细胞测定法。卷。43(2),101-109,2001。PMID:11169574。
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