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准备中期蔓延:细分细胞上的故障

动画片染色体的图象在简单的背景散开了与一个拷贝染色体的在焦点素的准备的中文地区蔓延

细胞遗传学是赋予染色体研究的遗传学的分支。基因组中的染色体不稳定性和染色体重排用于诊断和定义几种遗传疾病,甚至一些癌症。[1,2]研究人员使用各种技术来识别染色体的结构,包括荧光原位杂交(FISH)、染色体组分型、流式细胞术和比较基因组杂交(CGH)。

即使您不是一个细胞遗工,您可能需要评估某种细胞系中的染色体不稳定性,例如,在使用它们的论文项目之前(特别是如果您使用胚胎干细胞)。[3,4]

评估染色体不稳定性或染色体重排的第一步是收获染色体,其本身可以是艺术形式的一点。

准备中期蔓延的第一步

首先,在收获之前,您的细胞需要大约80%的融合(和健康!)。如果您没有足够的细胞,则可能不会最终有足够的染色体进行进一步分析。

阻止细胞周期

下一步是阻止细胞周期。在中期停止细胞周期对于研究染色体是至关重要的,因为这是它们最浓缩的时候,便于观察。一些常见的中期阻滞剂包括秋水仙碱、地可霉素、长春碱和诺可达唑。(5、6)

Demecolcin或Colcemid是最常见的化合物,用于捕获中期蔓延的细胞周期。[7,8] COLCEMID是秋水仙碱的合成类似物,其剧毒。[9,10]像血晶胺一样的长春碱是在植物中发现的天然化合物,但也已被证明是影响DNA合成,这很可能为什么不用于中期扩散。[11,12]

这些化合物中的所有四种化合物通过稳定的微管搅拌中期的细胞,这防止了主轴组件并激活主轴组件检查点。当与这些化合物中的任何一种一起温育时,细胞将不能进入后源。

收获的时间

一旦你在中期捕获了你的细胞,就是开始收获的时候了!这几乎与收获细胞颗粒相同的方式,除了你将媒体与COLCEMID保留,而不是将其倒在一起。将Cocecemid-Spiked介质倒入锥形管中,然后促使您的细胞呈蛋白质化。一旦细胞脱离,用储存的COLCEMID掺入介质稀释胰蛋白酶。离心你的细胞,取出上清液,你将留下一种中期滞留细胞的颗粒。

这是第一个棘手的部分:使细胞脆弱。对于中期蔓延,我们需要破裂细胞膜以帮助可视化染色体。细胞需要精细使它们在掉在显微镜载玻片上时将突发。

为此,我们需要向细胞添加低声溶液,其相对于细胞内部具有较低浓度的溶质。这导致渗透梯度在外部和细胞内部之间形成形成。因此,添加低级溶液使细胞膨胀,使它们非常脆弱。想想像水气球这样的细胞:你想要他们足够完全,以便他们在击中某些东西时爆裂,但不够完全闯入你的手!

实现这种平衡的最简单方法是一次每次添加低声解决方案,而不是立即添加全部量。这样,您可以缓慢慢慢悬垂您的细胞,从而允许均匀膨胀。你想确保你的管中没有丛生的细胞。轻轻地敲击管应分解任何不需要的细胞团块。用于中期涂抹的最常见的低渗溶液是氯化钾,但有些方案使用柠檬酸钠。[13-15]

有这种想法

一旦细胞在低渗溶液中培养,你就需要将其固定在这种肿胀状态,以便储存起来以备将来使用。甲醇和醋酸的结合似乎是最常见的固定方法染色体收获。单独使用酒精,如甲醇,会导致细胞萎缩。加入与肿胀有关的乙酸,可以使细胞保持在不太肿胀的状态。你可以将这些细胞以颗粒的形式储存在4°C下一年或者直接进入下一步。[7]

准备幻灯片

使中期染色体蔓延到幻灯片上是染色体收获的最困难的部分,并且有大量的辩论在最终传播中最有影响力。

一旦您准备好使您的中期蔓延,几次将你的细胞颗粒重悬于新鲜固定剂中。在将它们丢弃到幻灯片之前,这将有助于摆脱任何细胞团块。

诀窍是让重力帮你完成任务,但你可能需要花些时间优化距离。如果你的玻片和移液管之间的距离太大,你的染色体就会分散得太远。当染色体相隔太远时,可能很难确定它们是来自一个细胞还是两个细胞。这可能是一个大问题,如果你试图评估你的细胞的倍性。[16]

如果你的玻片和移液管之间的距离太小,你的染色体就会重叠并被挤在一起。当你的染色体重叠时,你将无法区分它们。这将使任何你可能做的染色难以评估。使用一次性移液管将细胞滴到干净的载玻片上,但要记住移液管的直径也会影响载玻片上的染色体扩散。

湿度是中期扩散过程的重要组成部分,也是影响染色体在载玻片上扩散的最重要因素。定影剂从空气中吸收水分,使现在破碎的细胞重新水化。控制这个复水过程的关键是美丽的中期扩散!

保持载玻片湿度最常用的两种方法是:

  • 在将电池滴到它们之前,将滑块与水略微潮湿(通过将载玻片浸入水中或预冻干),然后允许它们在热块上干燥。
  • 使用干幻灯片,滴下细胞,然后立即将载玻片放在覆盖的水浴中的托盘上。

方法的选择取决于个人,但总的信息是要保持潮湿!

干燥载玻片时,根据方案,温度可从20°C到75℃。[6,7,13,18,19]更高的温度会导致固定剂过快地干燥。太冷的温度可能导致幻灯片上的水分增加,因为冷空气不能像暖空气那样占用水。这可能导致你的固定剂干燥得太慢。当干燥时间影响染色体传播时,重要的是找到温度和湿度的正确组合,以优化用于细胞的染色体散布。[17]

关于准备中期扩散的最后思考

一旦你的幻灯片干燥,染色体固定到位,它们就准备好了下游应用,如免疫染色.在准备下一张幻灯片之前检查一下你的第一张幻灯片可能会有帮助。这样,您就可以根据在显微镜下看到的染色体扩散情况对您的方法(如距离、湿度和温度)进行任何调整。

最重要的是,记住,完善你的中期传播是一门艺术!循序渐进地遵循协议是一个很好的开始,但是您需要根据需要优化您的方法。如果您需要可视协议或一些故障排除技巧,请查看来自培养细胞的染色体制剂由豪.[5]

你有什么解决染色体采集问题的小窍门吗?请在评论中告诉我们。

引用:

  1. 王,n。“癌细胞源和分子细胞遗传学中的方法“,美国医学遗传学杂志Vol。115(3),P118-124,2002。
  2. Hochstenbach,R.等,“全基因组测序取代后核型蛋白划算时未检测到的临床相关染色体异常的调查“,欧洲医学遗传学杂志Vol.62(9),103543,2019。
  3. Bolhaqueiro,A.等,“正在进行的染色体不稳定性和人结肠直肠癌有机体中的核型演变“,自然遗传学Vol.51,824-834,2019。
  4. 三浦,M,等人,在小鼠骨髓间充质干细胞中积累的染色体不稳定性导致恶性转化“干细胞Vol.24(4),1095-1103,2006。
  5. Zulkipli, Ihsan N.等人,”药用植物:靶向细胞分裂的潜在化合物来源Drug target insights vol.9, 9-19, 2015
  6. 莫拉利,D。等,“一种改进的人ES和IPS细胞染色体分析技术“干细胞评测和报告卷。7,(2),2011年471-477
  7. Howe, B,等人,来自培养细胞的染色体制剂“可视化实验杂志。83,50203,2014。
  8. 舒克,p.l.等人,”钓鱼损伤中期染色体”。Balakrishnan L.,Stewart J.(EDS)DNA修复。分子生物学的方法,VOL。1999年,2019年。
  9. Finkelstein, Yaron等人秋水仙碱中毒:一种古老药物的阴暗面。“临床毒理学卷。48,5,007-414,2010。
  10. 里德,C,等人,"秋水仙和有丝分裂周期“细胞科学,Vol。102,387-397,1992。
  11. 穆哈达特,新墨西哥州等人。”人类培养淋巴细胞中长春碱,芳细胞和血红素肠道遗传毒性评估:对比研究《北京化工大学学报》vol. 19(1), 13-20, 2016。doi: 10.1515 / bjmg - 2016 - 002
  12. 威廉姆斯,J.,Carpentieri,U.“胚胎中的中期抑制化合物”。《自然》,第216卷,613-614期,1967。
  13. 米歇尔兰等人,"一种可靠的高质量中期蔓延的方案,用于原位杂交”。技术提示在线Vol。3,126-127,1998。
  14. Kotsarenko, K,等人,长期培养蜱细胞系的核型变化”。科学报告第10卷,13443页。2020.
  15. Utsumi, K.等人,"染色体I的研究I.用低渗溶液治疗揭示染色体的未磁化: Cell Structure and Function vol. 1, 93-99, 1975。
  16. Bakker,Bjorn等人。“如何计数细胞中的染色体:当前和新技术的概述《生物论文集:分子、细胞和发育生物学的新闻和评论》,第37卷,5,570 -577页,2015
  17. 邓,W.等,“一种改善中期染色体蔓延的新方法《细胞术》,vol. 51A(1), 46-51, 2003。
  18. Purbeck, j。l。等人染色体蔓延的动态”。AM J MED GENET;卷。61(4),387-393,1996。DOI:10.1002 /(SICI)1096-8628(19960202)61:4 <387 :: AID-AJMG15> 3.0.co; 2 o。PMID:8834053。
  19. Henegariu,O.等人,“细胞遗传学切片制备的改进:控制染色体扩散,化学老化和逐渐变性“血细胞计数。43卷(2),101 - 109年,2001年。PMID: 11169574。
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