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问化学家:比色法是如何起作用的

问化学家:比色法是如何起作用的

我的一个同事是一个非常好的分子生物学家告诉我,她唯一一次使用化学的时间是当她需要计算摩尔时。当然,我当然嘲笑了这一陈述,并试图提醒她每天使用的所有化学品。确实,自从我是化学家以来,我可能有点偏见,但肯定地,所有发色团,荧光团和成像探针等涉及一些化学和化学反应的知识。她耸了耸肩,并回答说他们都提供在套件中。

因此,为了防御所有化学书呆子,这是我的反驳:即使是最传统的分子生物学家也几乎每天都会进行化学反应。通过离子交换树脂和亲和柱的纯化,以计算蛋白质浓度和偶联的生物缀合物,化学在它背后。对于本文,我将专注于几个比色测定,希望说服您对这些化学反应的知识有助于执行这些测定和了解结果,以及在事物开始时进行故障排除。

通过利用电子特性和特定发色团的波长,我们可以推断大量信息。比色测定有助于我们将特定酶与另一酶区分定量催化活性,以及​​抑制该活性,以产生增殖性和毒性谱,甚至确定溶液中蛋白质的浓度。它们是可视化生物过程的简单方便的方式。作为迈尔德的前PI曾经说过,在他厚厚的德国口音中,同时指着他的眼睛,“自然为我们提供了我们自己的分光光度计,没有?”

甚至更具吸引力,许多比色测定作为套件,通常具有详细方案。实际上,在化学和生物学中定期使用比色测定,以覆盖它们所有都会占用一本书。因此,为了简单起见,本文将专注于两个磷酸酶测定。

激酶和磷酸酶通过蛋白磷酸化和去磷酸化介导多种细胞过程,如代谢、基因转录和翻译、蛋白-蛋白相互作用和凋亡。因此,许多不同的技术,包括各种比色法,存在于检测这些酶及其活性。

par-Nitrophenylphosphate

测定机制

par- 硝基苯基磷酸盐(P.NPP)广泛用作合成基底以测量各种磷酸酶的催化​​活性。

问化学家:比色法是如何起作用的

磷酸基P.NPP被酶切割以产生P.硝基苯酚,它也是无色的,因为其波长最大为电子激发P.- 水中的硝基酚是318nm。但是,在碱性条件下,P.- 硝基苯酚被转换为P.-nitrophenolate阴离子,导致红移(根据溶液条件,化合物的吸光度向较长波长的变化)到约400 nm。这是电磁波谱的蓝色边缘,但由于我们看到的是反射光的颜色(与吸收光相反),溶液看起来是黄色的。

要记住的事情……

其中一个伟大的卖点P.NPP测定是其简单性,因此很容易看出为什么人们可能会忘记这种游泳池(一个伟大的琐事词!)转变是对测定的关键因素。例如,如果酶活性需要最佳pH,则酸性磷酸酶恰好是这种情况。在这种情况下,需要终点加入强碱(例如氢氧化钠或氢氧化钾),以获得所需的黄色。

孔雀石绿色

测定机制

par- 硝基苯基磷酸盐测定很大,但如果您最喜欢的磷酸酶没有有效地代谢P.NPP吗?另一种商用的磷酸酶测定方法是孔雀石绿测定法。这个简单的测定方法是基于孔雀石绿、钼酸铵和游离正磷酸盐(又名无机磷酸盐,Pi)在酸性条件下形成的络合物。

问化学家:比色法是如何起作用的

在硫酸溶液中,正磷酸盐被磷酸酶裂解从被磷酸化的底物中释放出来,与钼酸铵形成络合物。孔雀石绿磷钼酸盐络合物的形成,在620-650 nm测量,因此直接与游离正磷酸盐的浓度有关。因此,从蛋白质磷酸酶底物中量化磷酸化和磷酸盐释放是可能的。

要记住的事情……

本试验只测定无机游离磷酸盐;在测量之前,有机磷酸盐(脂质结合或蛋白质结合的磷酸盐)必须首先被水解和中和。了解不同种类有机磷及其各自不同的水解自由能对测定条件的优化。的高能有机磷(缩醛磷酸盐,phosphoanhydrides等)拥有acid-labile磷酸基,可以通过孵化释放到溶液在低博士另一方面,低能有机磷(phosphoesters)在酸性溶液是稳定的和需要更严厉的条件(如热分解)能够检测到这种方法。

在孔雀石绿色过量的存在下,3:1离子助助剂((mg+)3.(PMO.12O403 -))可以容易地在酸性水溶液中形成和沉淀。为了稳定水溶液中的1:1离子梭菌,将聚乙烯醇加入溶液中。

在测定过程中要考虑的另一件事是任何可能干扰测定的氧化还原反应的可能性。钼是一种过渡金属,因此以多种氧化态存在。在钼酸盐阴离子中,它的氧化态是+6。酸化Mo(VI)溶液的还原由有机化合物,如抗坏血酸和还原糖(即葡萄糖),或无机化合物,如SnCl2,创建MO(iv)种类,其颜色为蓝色。

这两个例子仅仅是比色法的表面。想想所有用于检测过氧化氢的过氧化氢酶测定法(如Sigma 's quione亚胺衍生的测定法),当然还有非常流行的基于mtt的测定细胞毒性的测定法。更好地理解这些测定中所涉及的化学成分有助于更深入地理解反应,以及任何可能的故障排除程序,这将在以后讨论。

比色测定只是化学和生物学在手中在科学研究中携手的方式之一。我认为这是公平的,说多学科方法现在被认为是在药物发现过程中向前发展的重要方法。我的化学生物学教授评论说,在“古老的日子”中,它足以学习药用化学,制药公司会教你休息。现在,预计药物化学家将理解药理学,细胞生物学和分子生物学技术。它需要整个人团队,涉及许多专业,以便在制定安全有效的药物方面取得成功。但这还不足以让许多合作者涉及;我争辩说,各方都需要学会偶尔认为相似。所以希望下次我上述同事表演比较的测定,除了她的“分子生物学帽”之外,她还可以让她的“化学帽”,并记住药物研究是跨学科的艺术。

4评论

  1. 艾略特 2018年11月19日上午9:53

    对于孔雀石绿色测定,如果在软饮料上进行,避免由于其他化合物的干扰导致的最佳方法是什么?

  2. 查尔斯 2016年11月30日在下午3:01

    任何人都可以解释为什么PNPP Reacyion机制需要二乙醇胺?

  3. viraj 2016年6月1日上午2:40

    完全同意……这不仅仅是比色法,而且几乎分子生物学中的所有东西都需要你理解化学,如果你想知道和解释分子水平上发生的事情。我是一名分子生物学硕士,化学硕士,没有生物化学的知识,我认为一个分子生物学家是不完整的。

  4. eajsimko. 2013年4月26日上午5:19

    好文章!当套件几乎完全缺乏对实际情况的描述时,每个人都倾向于忘记他们每天要做多少化学反应。“将缓冲区B添加到缓冲区E,然后把它放在蓝色列中……”

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